Гіпергомоцистеїнемія та репродуктивна патологія

гіпергомоцистеїнемія та репродуктивної патології

Веачеслав Мошин, Аліна Хотінеану, Адріан Крецу, Віталій Скурту, Юліана Холбан

Стаття опублікована в "Бюлетені перинатології" від Rep. Молдова, 2014 р., №1 (61)

Гіпергомоцистеїнемія визначає стан, при якому концентрації небілкової амінокислоти - гомоцистеїну - перевищують нормальні межі. Мутації в генах циклу фолієвої кислоти (MTHFR, MTR, MTRR) вносять великий внесок, особливо поряд з безвітамінною дієтою, особливо з комплексу В. На даний момент гіпергомоцистеїнемія є фактором ризику ускладнень вагітності, таких як: розрив плаценти, прееклампсія, дефекти нервової трубки, обмеження внутрішньоутробного росту, викидні. У зв'язку з цим гомоцистеїн токсичний для судин і може ініціювати каскад судинних ускладнень, включаючи утворення тромбу. Генетичне тестування пацієнтів дозволить оцінити ризик гіпергомоцистеїнемії та тромбозу із зазначенням відповідного лікування та моніторингу вагітності.

гіпергомоцистеїнемія

Гомоцистеїн (Hcy) - це сірковмісна небілкова амінокислота, відсутня у природному раціоні та метаболічний проміжний продукт у реакціях трансметилювання та транссульфурації - важливі реакції в нормальному рості, функціонуванні та диференціації клітин [8]. У плазмі крові Hcy міститься у різних формах: 70% загального гомоцистеїну (tHcy) циркулює у зв’язаній з білками формі через дисульфідні взаємодії (переважно альбумін) [19]; близько 25% виявляється у формі димерів гомоцистеїну, а решта (5%) - пов’язана з іншими тіолами, включаючи цистеїн, знижену Hcy та окислену [22].

Рівень Hcy у плазмі збільшується з віком через зниження метаболізму Hcy у нирках. У жінок рівень Hcy нижчий, ніж у чоловіків, частково через вплив статевих гормонів (естрогену та прогестерону) та менструацій [20].

В оптимальних фізіологічних умовах кількість Hcy на клітинному рівні регулюється двома альтернативними метаболічними шляхами: незворотна деградація шляхом транссульфуризації або реметилювання з утворенням метіоніну [3]. Трансульфуризація, яка відбувається особливо в печінці та нирках, полягає у конденсації Hcy із серином, що призводить до утворення цистатіоніну за участю ферменту цистаціонін-β-синтази та вітаміну В6 як кофактора. На наступному етапі цистатіонін-γ-ліаза розкладає цистатіонін до цистеїну та α-кетобутирата. Цистеїн окислюється до атома сірки з утворенням неорганічного сульфату, що виділяється із сечею [3]. З іншого боку, цистеїн є попередником глутатіону - антиоксиданту, необхідного для детоксикації ксенобіотиків.

Альтернативно, Hcγ реметилюють до метіоніну за допомогою метил-5-метилтетрагідрофолату (5-метилTHF) або донора бетаїну [16]. Таким чином метаболізм Hcy тісно пов’язаний з фолатовим циклом: фермент метіонінсинтаза (MTR) каталізує перенесення метильної групи з 5-метилTHF в Hcy з утворенням метіоніну та THF (тетрагідрофолату), реакція, яка відбувається у всіх клітинах, крім еритроцитів. MTR вимагає кофактору кобаламіну (Cbl), а утворений комплекс Cbl (I) MTR пов'язує метильну групу, що призводить до MTR Cyl (III). Після перенесення Cbl (I) MTR реформується і може приймати іншу метильну групу. Одночасно кобаламін злегка окислюється до форми Cbl (II), і комплекс Mbl Cbl (II) стає неактивним. Інший фермент - метіонін синтаза редуктаза (MTRR) - має функцію реактивації комплексу Cbl (II) MTR шляхом відновного метилювання [14].

Згодом перетворення ТГФ в 5,10-метилен ТГФ каталізується ферментом MTHFD1, і фермент повинен відновити метильну групу до рецитирування Hcy. MTHFR який знижує 5,10-метиленТГ до 5-метилТГ, кофактором є вітамін В2 (рибофлавін).

Рисунок 1. Обмін гомоцистеїну: шлях реметилювання метіоніну та шлях транссульфуризації з утворенням таких продуктів, як цистеїн та сульфат

Гіпергомоцистеїнемія (HHcy)

HHcy є наслідком дефіциту ферментів та/або дефіциту поживних речовин вітамінів, які заважають нормальному метаболізму метіоніну та/або Hcy. Збільшення концентрації позаклітинної Hcy є токсичним для клітин і тканин і може ініціювати каскад судинних ускладнень [25]. Нормальні межі Hcy становлять від 5 до 15 мкМ [11]. Більш високі значення пов’язані з формами: проміжний (15-30 мкМ), помірний (30-100 мкМ) і важкий (> 100 мкМ) ГХГС [12]. Існує складна взаємодія між генетичними, метаболічними та екологічними факторами, щоб підтримувати рівень гомоцистеїну в межах норми. Зміни фактора або комбінації факторів можуть збільшити рівень tHcy (загальний гомоцистеїн). За даними Steeed [25], було вивчено 4 умови, які пояснюють розвиток HHcy: 1) дієта, багата метіоніном; 2) авітаміноз (В12, В6 і фолат);
3) порушення функції нирок; 4) генетичні відхилення (у генах MTHFR, MTR, MTRR, CBS).

Рисунок 2. Фактори гіпергомоцистеїнемії (HHcy): 4 шляхи накопичення гомоцистеїну

Розглянемо їх детальніше:

1) Половина кількості метіоніну, що надходить під час прийому їжі, перетворюється на Hcy [7]. Дослідження на тваринах показують, що багата метіоніном дієта у присутності вітамінів В6, В12 та дефіциту фолієвої кислоти може збільшити ризик атеросклерозу та ішемічної хвороби судин, тоді як дієта, багата рослинною їжею та фруктами, підтримує рівень Hcy у межах норми [1].

2) Кофактори, отримані з вітамінів групи B (B2, B6, B9, B12), беруть участь у ферментативних реакціях, що регулюють метаболізм Hcy. Кілька досліджень показують, що особи з гіпергомоцистеїнемією мають неадекватні концентрації одного або декількох кофакторів ферментів [23]. А концентрація Hcy обернено пропорційна концентрації фолієвої кислоти, вітаміну В12 і В6 у плазмі [10]. Фолієва кислота (розчинна форма вітаміну В9) необхідна для поділу та диференціації клітин, особливо під час вагітності. Похідні фолієвої кислоти є донорами монокарбонових одиниць для синтезу пуринових та піримідинових компонентів ДНК і РНК, а шляхом клонування металевої групи - бере участь в епігенетичній регуляції.

3) Нирки представляють головне місце метаболізму Hcy, що містить 3 ферменти: MTR, CBS та цистаціоін-γ-ліазу [9]. Дисфункція нирок супроводжується підвищенням рівня tHcy, і дослідження Арнадоттіра показують обернено пропорційну залежність між виміряною швидкістю клубочкової фільтрації та рівнем tHcy.

4) Генетичні відхилення ферментів метаболізму Hcy можуть спричинити збільшення концентрації tHcy, а ступінь вираженості змін залежить від місця мутації гена [25]. Найбільш прийнятним поліморфізмом, пов'язаним із мінливістю Hcy, є 677C> T в гені MTHFR, який замінює Ala у Val у складі ферменту. Кан та ін. виявили варіант ферменту MTHFR, що характеризується низькою активністю та "термолабільністю" [13]. Ферментативна активність у разі гетерозиготних генотипів CT та гомозиготних TT знижується на 35% та 70% відповідно [25], а термолабільна форма є генетичним маркером помірного HHcy у суб’єктів з генотипом 677TT (3). У той же час ця асоціація спостерігається лише одночасно з неадекватною концентрацією фолатів. Дослідження Гюнтлера (1999) показали в моделі E.coli, що ослаблення зв'язування FAD відповідає за зниження ферментативної активності, а захисну роль від втрати FAD відіграє навіть фоляція [6].

Поліморфізм 1298A> C гена MTHFR полягає в обміні Glu з Ala. Важливо, що ні гомозиготний, ні гетерозиготний статус поліморфізму не змінює рівень Hcy у плазмі [15]. Однак статус гетерозиготної сполуки для C677T та A1298C пов'язаний із зниженою ферментативною активністю, високим рівнем Hcy та низькою концентрацією фолатів у плазмі [5].

У поліморфізмі 66A> G гена MTRR ізолейцин заміщений метіоніном. Деякі дослідження повідомляють про цей поліморфізм як фактор ризику DTN (дефекти нервової трубки) [21].

Гомоцистеїн та серцево-судинні захворювання

Перші докази потенційного негативного впливу Hcy на судинну стінку повідомив Маккаллі в 1969 р. [18]. Подібні судинні ураження були виявлені у 2 пацієнтів з важкою формою HHcy через вроджені помилки метаболізму Hcy, а "Теорія гомоцистеїну" постулює, що Hcy та його похідні токсичні для судин. З іншого боку, результати мета-аналізів, що охоплюють 24100 суб'єктів, показують, що терапія нормалізацією гомоцистеїну не знижує ризик інфаркту міокарда та мозку, що пояснюється тим, що ці тести базувались на призначенні фолієвої кислоти [17]. Доповнення фолієвою терапією корисно, з одного боку, але антагоністичний ефект полягає в прискоренні проліферації та запалення - найважливіших процесів у формуванні атеросклеротичного нальоту, головним чином завдяки ролі метаболізму фолатів у забезпеченні монокарбонових одиниць для синтезу пурину та піримідеїну в структурі ДНК. РНК [4].

Недавні дослідження описують 3 патологічних механізми, що лежать в основі судинних ускладнень, спричинених Hcy: окислювальний стрес, дисфункція ендотелію та ремоделювання судин - інтегровані в "токсичну тріаду" [4].

Рисунок 3. Токсична тріада: Патологічні механізми, що лежать в основі судинних захворювань, спричинених гомоцистеїном.

Дослідження показують, що Hcy в основному атакує судинний ендотелій і ініціює каскад судинних ускладнень. Клінічні спостереження та дослідження на тваринах виявили можливі мішені Hcy: EC (ендотеліальні клітини), VSMC (м’язові клітини), сполучні тканини, тромбоцити, фактори згортання, ліпіди, молекули передачі сигналу NO (оксиду азоту) [25 ]. Однак немає єдиної гіпотези, яка б пояснила, як Hcy спричинює пошкодження судин. Молекулярні та клітинні ефекти HHcy відображені в таблиці 1.

Таблиця 1. Механізми гіпергомоцистеїнемії

Молекулярні ефекти HHcy	Клітинні ефекти HHcy
Зниження виробництва NO (оксиду азоту)	Порушення функції ендотелію
Зменшення кількості доступного NO	Порушення вазорелаксації ендотеліальних клітин
Окислювальний стрес	Пошкодження мітохондрій
Перекисне окислення ліпідів	Проліферація клітин гладких м’язів
запалення	Деградація позаклітинного матриксу
коагуляція	Пошкодження ДНК та РНК
Утворення тромбу	апоптоз

Матеріали і методи: До дослідницької групи входили пацієнти Медичного центру з репродуктивними проблемами, включаючи викидні та повторні викидні. Геномну ДНК екстрагували після спеціалізованих наборів (Mini Kit для очищення геномної ДНК цільної крові, Fermentas) з лейкоцитів периферичної крові. Зразки крові відбирали в одноразові пробірки з ЕДТА методом венепункції.

Для генетичного тестування поліморфізмів MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTR A2756G та MTRR A66G проводили реакції PCR/RFLP (ланцюгова реакція полімеризації та поліморфізм довжини фрагментів рестрикції) з конкретними праймерами, взятими зі статей у літературі. 27.24]. Геномну ДНК ампліфікували за допомогою полімерази Dream Taq ("Fermentas", США) в термоциклі "TProfessional Basic 96" (Біометра, Німеччина). Умови реакції подібні для всіх поліморфізмів, крім температури вирівнювання праймерів: 60,4 ° C для MTHFR C677T, 61 ° C для MTHFR A1298C, 58,4 ° C - MTR A2756G, 57,6 ° C - MTRR A66G, а стандартні умови протоколу: денатурація початковий при 95 ° C - 3 хвилини, 33 цикли: 94 ° C - 30 секунд, 57,6 - 61 ° C - 30 секунд, 72 ° C - 30 секунд і остаточне подовження при 72 ° C - 5 хвилин.

Амплікони обмежували протягом 3 годин при 37 ° C з ферментами рестрикції, специфічними для кожного поліморфізму: Hinf I для MTHFR C677T, Mbo II для MTHFR A1298C, Hae III - MTR A2756G та Nde I - MTRR A66G.

Перевірку продуктів рестрикції проводили гель-електрофорезом PAAG (поліакриламід) у концентрації 7,5% - за умов: 200 В протягом 3 годин. Гель фарбували розчином броміду етидію. І результати були переглянуті в системі UV SOLO (Німеччина). Розміри фрагментів відображені на малюнку 4.

Малюнок 4. Електрофореграма ПЛР/RFLP аналізу поліморфізмів гена циклу фолатів:

А) MTHFR C677T: M - маркер 50 п.о .; 1 - амплікон (227 п.н.); 4 - 8 - нормальний гомозиготний (205 п.н.); 2 - гетерозиготний (205, 129, 76 п.н.); 3 - гомозиготний після мутації (129, 76 п.н.);
Б) MTHFR A1298C: M - маркер 50 п.о .; 1 - амплікон (163 п.н.); 4 - нормальний гомозиготний (56, 31, 30, 18 п.н.); 3, 5, 7 - гетерозиготний (84, 56, 31, 30, 18 п.н.); 2 - гомозиготний після мутації (84, 31, 30, 18 п.н.);
В) MTR A2756G: 2, 3, 5, 6, 9 - нормальний гомозиготний (421, 81 п.н.); 1, 4, 7, 8 - гетерозиготний (421, 269, 152, 81 п.н.); 10 - гомозиготний після мутації (269, 152, 81 п.н.);
D) MTRR A66G: M - маркер 50 п.о .; 2-амплікон (145 п.н.); 5, 6 - нормальний гомозиготний (145 п.н.); 4 - гетерозиготний (145, 123, 22 п.н.); 3 - гомозиготний після мутації (123, 22 п.н.).

Результати та обговорення: Результати генотипування представлені на діаграмах 1 - 4. Для оцінки достовірності отриманих результатів використовували загальноприйняті формули з варіаційної статистики за допомогою програми SISA. У цьому контексті частоти алелів та генотипових класів розраховували за формулою Харді-Вайнберга, а для порівняння частот генотипів використовували критерій Пірсона - X 2 .

Діаграма 1. Розподіл частоти генотипових класів за поліморфізмом MTHFR C677T

Діаграма 2. Розподіл частоти генотипових класів за поліморфізмом MTHFR A1298C

Діаграма 3. Розподіл частоти генотипових класів згідно поліморфізму MTRR A66G

Діаграма 4. Розподіл частоти генотипових класів за поліморфізмом MTR A2756G

При порівнянні частотного розподілу спостережуваних генотипів та теоретично передбачених тестом X 2 статистично значущих відхилень від рівноваги Харді-Вайнберга для досліджуваного поліморфізму не вияснили: MTHFR C677T (X 2 = 0,575; р> 0,05); MTHFR A1298C (X 2 = 3 766; p = 0,052); MTR A2756G (X 2 = 2,332; p> 0,05); MTRR A66G (X 2 = 2230; р> 0,05);

1) Гомоцистеїн у великих кількостях надає токсичну дію на ендотелій судин, стимулюючи утворення тромбу.

2) Гіпергомоцистеїнемія є фактором ризику ускладнень вагітності в різний час, включаючи прееклампсію, відшарування плаценти, обмеження внутрішньоутробного розвитку та викидні.

3) Генетичне тестування після мутацій в генах метаболізму гомоцистеїну та фолієвої кислоти дозволяє оцінити ризик та призначити відповідне лікування.