Ідентифікація білків з кіназною активністю - Людина - Їжа - Навколишнє середовище

принцип

Масив фосфо-MAPK людини та масив -RTK для визначення відносних рівнів фосфорилювання активованих мітоген-активованих протеїнкіназ (MAPK), тирозинкіназ (RTK) та інших серин/треонінакіназ

Серед каскадів внутрішньоклітинної трансдукції сигналу є кінази активованих мітогеном

Набір людських наборів фосфо-MAPK для виявлення множинних фосфорильованих кіназ в оброблених, а також необроблених клітинах.

Родина протеїнкіназ (MAPK) відіграє центральну роль. Сімейство MAPK поєднує низку серинових/треонінкіназ, таких як ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), Jun-кінцеві кінази Jun і p38-MAPK. Стимуляція клітини, наприклад, мітогенними факторами, як правило, призводить до збільшення активності MAP-кінази. Наприклад, ERK-1 і -2 потім транслокуються в клітинне ядро і активують фактори транскрипції, що згодом призводить до проліферації клітин або диференціації клітин, тоді як інгібування MAPK пригнічує ці процеси. При конститутивній активації цих кіназ може відбуватися неконтрольований ріст клітин, що відіграє важливу роль у пухлинному генезі. Подібним чином, підвищена активність ERK асоціюється із збільшенням потенціалу пухлини до інвазивності та метастазування.

Ці кінази можуть активуватися різними рецепторними лігандами, завдяки чому механізм активації ERK1/2, опосередкований рецептором тирозинкінази, добре характеризується. Рецепторні тирозинкінази (RTK) є важливими медіаторами фізіологічних клітинних процесів, таких як проліферація, диференціація, рухливість або регуляція виживання клітин. RTK включає рецептор епідермального фактора росту (EGF) та рецептор інсуліну. Коли ліганд рецептора зв'язується зі специфічним сайтом зв'язування RTK, відбувається зміна конформації та подальша димеризація рецептора. Це призводить до трансфосфорилювання двох мономерів. Фосфорильовані залишки тирозину активованого рецептора утворюють точку стикування білків-адаптерів, які потім здатні ініціювати каскад протеїнкінази. Цей принцип також може спостерігатися при застосуванні інших рецепторних тирозинкіназ.

За допомогою людського фосфо-MAPK-масиву та людського фосфо-RTK-масиву можна виміряти статус фосфорилювання великої кількості сигнальних молекул, а також фосфорилювання рецептора в процесі передачі сигналу. Перевагою цих масивів є велика кількість записаних кіназ MAP та RTK:

Записаний MAPK (21 MAPK):

ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-pan, p38-α, p38-b, p38-g, p38d, RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt pan, MSK1, MSK2, HSP27, p70 S6-кіназа

Захоплений RTK (42 RTK):

EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, InsulinR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, Tie-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6

Принцип вимірювання

Спеціалізовані до кінази антитіла виділяються дублетами на нітроцелюлозній мембрані та інкубуються з підготовленим клітинним лізатом, причому фосфорильовані кінази зв'язуються з плямистими антитілами. На кожну пляму піпетують “коктейль” з антитіл проти 21 специфічної кінази, до кінця якої зв’язаний біотин. Для кожної плями створюється багатошаровий шар іммобілізованих антитіл, кінази та комплексу антитіло-біотин у формі «молекулярного сендвіча». Потім фактична реакція виявлення відбувається шляхом додавання стрептавідин-HRP та виявлення хемілюмінесценції.

Пробне оцінювання

Клітини обробляли субстратом протягом 15 хвилин або залишали необробленими. Після приготування клітинного лізату та інкубації з антитілами його виявляють за допомогою хемілюмінесценції. Потім оцифровані зображення обчислюються денситометрично, а інтенсивність пікселів відображається графічно.

витрати

Приблизно € 380 для 4 зразків для одночасного визначення 21 MAPK

Приблизно 450 євро для 4 зразків для одночасного визначення 42 RTK

Приклад застосування (загальний)

Регуляторний вплив харчових інгредієнтів на фосфорилювання сигнальних білків або рецепторів у контексті імунної відповіді (Wang et al. 2007 та Stehphen et al. 2007), а також вплив олігосахаридів молока на процеси перетворювачів сигналів (Kuntz et al. 2009).