IgG - ttg - Імунна відповідь при цукровому діабеті 1 типу із целіакією - PDF Безкоштовно завантажити
Університетська лікарня Ульм Центр внутрішніх хвороб Клініка внутрішніх хвороб I Медичний директор: Проф. Гвідо Адлер Фокус на ендокринології, діабеті та метаболізмі Проф. мед. Bernhard O. Böhm IgG - ttg - імунна відповідь при цукровому діабеті 1 типу з целіакією Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора стоматології на медичному факультеті Ульмського університету, представлена Тимо Кноче Бьоблінгеном 2010 I
Виконуючий обов'язки декана: проф. Клаус-Майкл Дебатін 1-й доповідач: проф. Бернхард Отто Бем 2-й доповідач: проф. День доктора філософії Пітера Керна: 22 квітня 2010 р. II
Зміст Список скорочень 1. Вступ 1 1.1 Визначення целіакії 1 1.2 Історія 2 1.3 Епідеміологія та патогенез целіакії 4 1.4 Форми целіакії 8 1.5 Целіакія та інші хвороби 12 1.6 Випуск 16 2. Матеріал і метод 17 2.1 Реагенти, розчини та буфери 17 2.2 Пристрої та витратні матеріали 19 2.3 Сироватки для пацієнта 20 2.4 Визначення титру 21 2.4.1 Визначення титру ttg-iga 21 2.4.2 Визначення титру ttg-igg 29 3. Результати 30 3.1 Визначення титру ttg-iga 30 3.2 Визначення титру ttg-igg 32 3.3 Пряме порівняння титрів ttg-igg з титрами ttg-iga 34 3.4 Обчислювальне порівняння титрів/статистичні результати 38 IV
4. Обговорення 43 5. Резюме 52 6. Бібліографія 53 Додаток V
Список скорочень AGA Антитіла проти гліадину APC Антигени, що представляють клітину BSA Бичача сироватка Альбумін CD Кластер диференціації DR, DQ HLA гени локусів на хромосомі 6 DZG Deutsche Zöliakie Gesellschaft e.v. ELISA твердофазного імуноферментного аналізу EMA ендомізіем Антитіла ESPGHAN Європейське суспільство педіатричної гастроентерології, гепатології та харчування GFD глютену дієту, глютену дієту H 2 SO 4 Сірчана кислота HLA людського лейкоцитарного ІФН Антигени Інтерферони IgA імуноглобулін типу А IgE Імуноглобулін E Тип IgG імуноглобулін Тип G IgM імуноглобулін типу M IL Інтерлейкін MHC Основний комплекс гістосумісності мл Мілілітри MMP Матриця Металопротеїнази mrna вісник Рибонуклеїнова кислота PBS Фосфат буферований сольовий TGF Фактор росту пухлини TMB Тетраметилбензидин TNF Пухлина Трансмутируючий замін Трансмутируючий замін Трансмутируючий замін Транглутема кашлю Ttagmagtagtagmagtagmagtagumin; довільна, довільна одиниця VI
- Контрольна біопсія показана у разі сумнівного клінічного успіху при безглютеновій дієті - Експозиція глютену при біопсії, зазначена в: - Сумніви щодо початкового діагнозу - Діагностика у віці 30/100 епітеліальних клітин) та нормальної архітектури слизової оболонки, гіперпластичний тип II, з гіперплазією крипти, збільшенням інтраепітеліальних лімфоцитів та нормальних ворсинок і деструктивний тип III з 3 підтипами а-с, який демонструє пухкі або сплюснуті ворсинки, гіперплазію крипти, збільшення внутрішньоепітеліальних лімфоцитів та запальний інфільтрат у власній пластині (DZG 2009). 11
Антитіла до ендомізію в нормальних межах, а також біопсія Дуденала показують нормальну картину. У пацієнтів із селективним дефіцитом IgA ризик розвитку целіакії в 10 разів вищий. Синдром Шегрена, випадання волосся та хвороба Аддісона - це інші розлади, які можуть бути пов’язані з целіакією. Ризик лімфоми в тонкому кишечнику найбільший у пацієнтів, яким діагностована целіакія у зрілому віці. Рак глотки та стравоходу також частіше зустрічається у хворих на целіакію. Однак останні дослідження 2004 року показують, що існує лише помірно підвищений ризик розвитку пухлини, і що дотримання суворого GFD призводить до коригування ризику для загальної популяції протягом 5-10 років (Mäki and Collin 1997, DZG 2009). 15-й
1.6 Проблема З впровадженням серологічної діагностики та виявленням антитіл поширеність швидко зросла. Стало ясно, що хворі на целіакію, зафіксовані під час біопсії, були лише верхівкою айсберга. Недоліками тестів на тканини, тестів на ендомізій та ретикулін є великі витрати та обмежена кількість субстрату, який потрібно отримувати з стравоходу мавпи. Крім того, для проведення цих випробувань вимагається спеціально навчений персонал, оскільки випробування технічно дуже складні. (Mäki and Collin 1997). Після виявлення антигену ttg можуть бути розроблені специфічні набори для кількісного виявлення антитіл. Такі тести, як Еліса, не тільки полегшили початковий діагноз, а й подальший контроль та діагностику. Загальні тести використовують антиген ttg для виявлення IgA та IgG антитіл. Ця дисертація була зосереджена на розподілі IgA та IgG анти-tTG-Ab у контексті діабету 1 типу. Метою є перевірити, чи дозволяють результати робити висновки про імунологічний процес і чи може це покращити діагноз. 16
2. Матеріал та методологія 2.1 Реагенти, розчини та буфери Celikey IgG PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Тканина Трансглютаміназа (людська, рекомбінантна) IgG Аналіз антитіл для діагностики in vitro Стрічки мікротитру (17996), покриті людським рекомбінантним антигеном TTG 6 TTG IgG) стандартні розчини антитіл у концентраціях 0 3 7 16 40-100 Од/мл у PBS з BSA 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію 1 позитивний контроль із BSA, 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію, миючого засобу та сироватки людини в PBS 1 негативний контроль з BSA, 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію, миючого засобу та сироватки людини в концентраті буферного промивного концентрату 20 разів концентрат PBS з 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію та буфер зразка миючого засобу з BSA, 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію та миючий засіб, кольоровий жовтий кон'югат IgG, пероксидаза IgG проти людини, кольоровий червоний Ферментний субстрат ТМВ (3, 3, 5, 5, тетраметилбензидин) стоп-розчин, 0,5 MH 2 SO 4, безбарвний 17
Celikey PharmaciaDiagnostics (Швеція Діагностика (Німеччина) GmbH) Тканина Трансглютаміназа (людська, рекомбінантна) Аналіз антитіл IgA для діагностики in vitro Стрічки мікротитру (18196), покриті людськими, рекомбінантними антитілами до ttg 6 ttg (IgA) Стандартні розчини в концентраціях 0-3- 7-16-40-100 Од/мл в PBS з BSA 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію 1 позитивний контроль з BSA, 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію, миючий засіб та сироватка людини в PBS 1 негативний контроль з BSA, 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію, миючого засобу та сироватки людини в концентраті для промивного буфера PBS 20x концентрат PBS з 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію та миючого засобу. Зразок буфера з BSA, 0,095% (мас./Об.) Азиду натрію та миючого засобу, кольоровий жовтий кон'югат IgA, Анти-людська пероксидаза IgA, забарвлений червоний ферментний субстрат ТМВ (3, 3, 5, 5, тетраметилбензидин) стоп-розчин, 0,5 MH 2 SO 4, безбарвний
2.2 Пристрої та витратні матеріали Eppendorf Hamburg - Довідник для піпеток - Multipipette Multipette plus - Combitipp 1,0 мл, 2,5 мл, 5,0 мл Sarstedt Nümbrecht - Наконечники піпеток жовті 10 100 мкл - Наконечники піпеток сині 100 1000 мкл Vortex - Шейкер Genie Ampuwa - Дистильований Water SLT - Вимірювач мікропланшетів Spectra Epson - принтер LX-400 Інше - звичайний персональний комп'ютер, MS Word 2003, MS Excel 2003 - Synelisa Software Ver. 3.2 липня 1995 р. - програми статистики Winstat та PASW Statistics 19 19
2.3 Сироватки для пацієнтів Використовували сироватки для пацієнтів, для яких вже були доступні титри IgA. Були відібрані ті сироватки, у яких титр IgA перевищував 8 ОД/мл, щоб уникнути прикордонних позитивних сироваток (сіра зона). З популяції 803 хворих на діабет 1 типу для визначення титрів IgA та IgG були відібрані 73 IgA позитивні сироватки з 44 жінок та 26 пацієнтів чоловічої статі. Неможливо визначити стать у 3 зразках. Вік пацієнтів коливається від 4 до 84 років. У 25 пацієнтів титр IgA перевищував 100 ОД/мл. Сироватки цих пацієнтів досліджували далі з відповідними розведеннями для кількісного визначення титрів антитіл. Таблиця 1: Огляд популяції, N = кількість Кількість віків N Чоловіки Жінки Невідоме дослідження Дослідження 1 59 20 38 1 4 84 Дослідження 2 14 6 6 2 11 83 20
23 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Рисунок 2: Стандарти схеми піпетування: чорний контроль: білий +/- пацієнти: білий, пронумерований
2.4.1.3 Графічне зображення процедури тесту = антиген трансглутамінази людини, рекомбінантної тканини як твердої фази Рисунок 3: Схематична установка тесту 1 з 10, піпетування зразків сироватки = антитіло до трансглутамінази тканини, = антиген трансглютамінази тканини рекомбінантної тканини як тверда фаза = інші компоненти клітини Рисунок 4: Схематична установка тесту 2 з 10 24
= Тканинне антитіло до трансглютамінази, = людський, рекомбінантний антиген трансглютаміназної тканини у вигляді твердої фази = інші клітинні компоненти 1-а реакція: Тілинні антитіла до трансглютамінази, що містяться в сироватці крові пацієнта, зв’язуються з антигенами. Інкубують протягом 30 хв. Антитіла = людський, рекомбінантний антиген трансглутаміназної тканини у вигляді твердої фази = інші клітинні компоненти Рисунок 6: Схематичне налаштування тесту 4 з 10 25
Піпетування в кон’югаті пероксидази проти людини = кон’югат пероксидази проти людини = антитіло до тканинної трансглутамінази = людський, рекомбінантний антиген трансглютаміназної тканини як тверда фаза у вигляді твердої фази 2-ї реакції: кон’югат поєднується з комплексом антиген-антитіло Інкубують 30 хв
3 х вимивання з порожнини промивним буфером = кон'югована анти-людська пероксидаза = антитіло до трансглутаміназної тканини = людський, рекомбінантний антиген трансглютаміназної тканини у вигляді твердої фази Рисунок 9: Схематична експериментальна установка 7 з 10 ТМВ піпетування в ферментний субстрат тетраметилбензидин = кон'югована анти-людська трансглютаміназа = пероксидаза людини = тканина, рекомбінантний тканинний антиген трансглутамінази у вигляді твердої фази = тетраметилбензидин Рисунок 10: Схематична експериментальна установка 8 з 10, ТМБ = тетраметилбензидин 27
= Кон'югатна анти-людська пероксидаза = антитіло до трансглутаміназної тканини = людський, рекомбінантний антиген трансглутаміназної тканини у вигляді твердої фази = тетраметилбензидин інкубувати протягом 10 хв у темряві Рисунок 11: Схема експерименту 9 з 10 = кон'югована анти-людська транс-пероксидаза = антитіло до трансгенної глютамінази тканини людини, антиген антиген до рекомкомбінану тканинної тканини Тверда фаза = тетраметилбензидин H 2 SO 4 = тетраметилбензидин після зміни кольору 3-я реакція: -Марковані ферментом комплекси кон'югат-антитіло-антиген встановлюють субстрат для зміни кольору субстрату з червоного на жовтий -реакцію зупиняють сірчаною кислотою -30 хв після зупинки можна фотометрично оптичні щільності визначаються при 450 нм Рисунок 12: Схематична експериментальна установка 10 з 10, H 2 SO 4 = сірчана кислота 28
Таблиця 2: Тест Колмогорова-Смірнова для нормального розподілу з корекцією значимості за Ліллієфорсом для ttg (iga) та ln [ttg (iga)], ttg (iga) = антитіла типу A проти тканинної трансглутамінази, ln = логарифм до основи e, n = число Колмогоров-Смірнов n Значення ttg (iga) 73000 ln [ttg (iga)] 73.032 Рисунок 13: Гістограма абсолютних значень титру ttg (iga) з нормальною кривою розподілу, ttg (iga) = антитіла типу А проти тканинної трансглутамінази Рисунок 14: Гістограма логарифмічної Значення титру для основи e ttg (iga) з нормальною кривою розподілу, ln = логарифм основи e, ttg (iga) = антитіла типу A проти тканинної трансглутамінази 31
Рисунок 15: Гістограма абсолютних значень титру ttg (igg) з кривою нормального розподілу, ttg (igg) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази Рисунок 16: Гістограма логарифмізованих значень титру для основи e ttg (igg) з кривою нормального розподілу, ln = логарифм до основи e, ttg (igg) = антитіло типу G проти тканинної трансглутамінази 33
3.3 Пряме порівняння титрів ttg-igg з титрами ttg-iga При прямому порівнянні результатів визначення титрів ttg-iga та титру ttg-igg та порівняльному графічному зображенні титрів випробовуваних стає очевидним: 93% (69 з 73) зразків мають Титр IgA вище титру IgG; у 7% з них (5 з 69) значення значно вище, ніж значення IgG (див. малюнок 17-24). Однак у 7% (5 із 73) зразків титр IgG вищий, ніж титр IgA (див. Малюнок 17-24). Переглядаючи стовпчасті графіки IgA та IgG у порівнянні, можна побачити наступне: Значення IgA та IgG не корелюють між собою, тобто H. високий титр ttg-iga не призводить до високого титру ttg-ig. - Так само низький титр IgA не асоціюється з низьким титром IgG і навпаки. - З іншого боку, якщо титр IgG високий, титр IgA також високий. ttg титр IgA-IgG у порівнянні 900 800 700 600 500 титр 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 номер проби ttg (IgA) ttg (IgG) Рисунок 17: титр ttg IgA-IgG у порівнянні, зразок номер 1 -10, ttg (IgA) = антитіла типу А проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази 34
ttg титр IgA-IgG у порівнянні 400350300250 титр 200 150 100 50 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Номер зразка ttg (IgA) ttg (IgG) Рисунок 18: титр ttg IgA-IgG у порівнянні, номер зразка 11- 20, ttg (IgA) = антитіла типу A проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази ttg титр IgA-IgG у порівнянні 500 450 400 350 300 титр 250 200 150 100 50 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Номер зразка ttg (IgA) ttg (IgG) Рисунок 19: титр ttg IgA-IgG у порівнянні, зразок № 21-30, ttg (IgA) = антитіла типу A проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази ttg IgA-IgG титр порівняно 1000 900 800 700 600 титр 500 400 300 200 100 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Номер зразка ttg (IgA) ttg (IgG) Рисунок 20: ttg IgA-IgG титр у порівнянні, Зразок № 31-40, ttg (IgA) = антитіла типу А проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази 35
ttg IgA-IgG титр у порівнянні 300250200 титр 150100 ttg (IgA) ttg (IgG) 50 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Номер зразка Рисунок 21: титр ttg IgA-IgG у порівнянні, номер зразка 41-50, ttg (IgA) = антитіла типу A проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази ttg IgA-IgG титр порівняно 1400 1200 1000 титр 800 600 400 200 0 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 номер зразка ttg (IgA) ttg (IgG) Рисунок 22: титр ttg IgA-IgG у порівнянні, номер зразка 51-60, ttg (IgA) = антитіла типу А проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази ttg IgA- Титр IgG у порівнянні 400350300250 титр 200150100 50 0 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Номер зразка ttg (IgA) ttg (IgG) Рисунок 23: ttg IgA-IgG титр у порівнянні, зразок номер 61-70, ttg (IgA) = антитіла типу А проти тканинної трансглутамінази, ttg (IgG) = антитіла типу G проти тканинної трансглутамінази 36