Індукція ішемічного інсульту та ішемії-реперфузії у мишей з використанням оклюзії середньої артерії

Вступ

Дослідження серцево-судинних захворювань, таких як інсульт, базується на використанні моделей in vivo. Для того, щоб зрозуміти можливі наслідки ішемії, токсичності лікарських засобів та/або лікування, необхідно використовувати відповідну, стандартизовану, надійну та відтворювану модель захворювання, що дозволяє проводити порівняльні дослідження між групами лікування. У цьому рукописі ми використовуємо мишей через наявність великої кількості трансгенних мишей та стандартизованих моделей оцінки. Рейтингові оцінки для оцінки рухових та поведінкових дефіцитів після експериментального ішемічного інсульту та після відновлення були розроблені 1, 2.

Доступні кілька моделей ішемічного інсульту, такі як повна глобальна церебральна ішемія, неповна глобальна ішемія, мультифокальна церебральна ішемія та фокальна ішемія головного мозку. Остання група також є категорією інсульту, найчастіше зустрічається у пацієнтів. Більшість напередодні є ініційованими утворенням емболічної або тромботичної оклюзії на середній мозковій артерії або поблизу неї. На тлі цих параметрів представлена ​​модель, що імітує етіологію захворювання інсульту людини, робить отримані результати надзвичайно актуальними 3. Тим не менше, переклад відкриттів з тваринних моделей на лікування захворювань у людей виявився складним. Наразі для лікування гострого ішемічного інсульту дозволено лише використання тромболітичного тканинного активатора плазміногену 4.

Серед моделей вогнищевої церебральної ішемії миші модель інсульту заднього мозкового кровообігу та модель тромбозу церебральних вен є дуже інвазивними, зменшуючи їх застосовність та обмежуючи діапазон аналізів, які можна провести. Однак інші методи, такі як емболічна модель, модель фототромбозу, індукована ендотеліном-1 модель інсульту та модель оклюзії мозкової артерії внутрішньопросвітнього шва (MCAO), доступні для використання без таких обмежень. Модель MCAO - це методика, описана в цьому протоколі. Він забезпечує надійний метод індукції фокальної ішемії головного мозку, який можна легко компенсувати та виконати з високою пропускною здатністю. Існує два підходи до цієї моделі, а саме методи Зеа-Лонга та Коїдзумі. Вони дещо відрізняються способом введення оклюзійного шва в судинну систему. У техніці Zea Longa нитка вводиться через зовнішню сонну артерію 5. Представлена ​​тут методика модифікована з процедури Коїдзумі, при якій оклюзійний шов накладається на загальну сонну артерію 6.

Модель MCAO була успішно застосована для оцінки різних подій, що відбуваються під час ішемічного інсульту. Після реперфузії можна спостерігати набряк головного мозку разом із руйнуванням гематоенцефалічного бар’єру. Пікова нервова смерть зазвичай спостерігається через 24 години; Однак він може повернутися до початкового рівня через 7 днів 7. У людини стать і вік є важливими змінними у визначенні результатів інсульту; це також спостерігалося у мишей та щурів 8, 9, 10. У кількох публікаціях показана модель MCAO які застосовували ефективність лікування 11, 12, 13, 14.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі процедури були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Маямі (IACUC) відповідно до керівних принципів Національного інституту охорони здоров'я (NIH). Потрібне використання в стерильному обладнанні та асептичних методах.

1. Підготувати оклюзійний шов

  1. Використовуйте шов діаметром 0,21 мм для мишей між 20-25 г та 0,23 мм для мишей з масою тіла 25-35 г. Вибір типу швів для процедури MCAO ґрунтується на вазі тварини.
  2. Срібною ручкою відзначте шов, починаючи з 9 мм від кінчика із силіконовим покриттям. Це послужить орієнтиром для довжини установки.

2. Підготовка до операції

3. Розсічення загальної сонної артерії та внутрішнього/зовнішнього розгалуження

4. Підготовка CCA до введення шва MCAO

  1. Помістіть три відрізки капронової нитки довжиною близько 4 дюймів під CCA. Переконайтеся, що CCA не перекручений, оскільки це суттєво ускладнить введення шва.
  2. У найнижчій точці зав'яжіть нижній шов на постійний вузол.
  3. Зв’яжіть верхній шов трохи нижче місця з'єднання ICA/ECA знімним ковзаючим вузлом.
  4. Зав'яжіть середній шов за допомогою знімного ходового вузла, але тримайте його широко відкритим. Важливо залишити багато місця, оскільки це не завадить вставити шов.
  5. Пружинними ножицями для мікродисекції зробіть надріз в CCA між нижнім і середнім швами. Зробіть розріз 0,2 мм біля нижнього шва.

5. Оклюзія середньої мозкової артерії

6. Закриття та післяопераційний догляд

  1. Знову знеболіть тварину (дотримуйтесь інструкцій у 2.1) та зніміть шви, що закривають рани.
  2. За допомогою щипців і сепараторів тканин знову відкрийте розріз і оголіть CCA.
  3. Ви обережно знімаєте верхній шов і обережно натягуєте шов MCAO, поки деталь із силіконовим покриттям не опиниться посередині вузла.
  4. Повторіть вищезазначений вузол на шві, щоб запобігти протіканню крові через шов (це не обов'язково повинен бути вузол ковзання).
  5. Обережно ослабте середній вузол і протягніть шов за верхній вузол, але тримайте його в межах CCA.
  6. Щільно закрийте артерію верхнього вузла, щоб перекрити кровотік.
  7. Повністю витягніть шов MCAO і щільно закрийте середній вузол.
  8. Шов MCAO можна повторно використовувати кілька разів. Після кожного використання обережно очищайте шов у 70% етанолі, щоб видалити забруднення (наприклад, кров або тканини) стерильною марлею. Після цього покладіть шов в пакет для стерилізатора і простерилізуйте його.
  9. Повторіть кроки 6.1-6.4 і стежте за відновленням тварин.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

На додаток до вивчення ударного обсягу, імунофлюоресценція може бути виконана для різних мішеней, таких як асоційований з мікротрубочками білок-2 (MAP2) для ураження нейронів. (3А) або гліальний фібрилярний кислий білок (GFAP) для астрогліозу (3B). Такі аналізи надалі дозволяють аналізувати прогресування та відновлення інсульту, а також інші процеси, пов'язані з пошкодженням та відновленням інсультової тканини.

ішемічного
Ілюстрація 1: дзвін> Схематичне зображення артеріальної фізіології мозку. Шлях введення MCAO протікає від загальної сонної артерії (CCA) до області оклюзії, позначеної синім кольором. (:;: Середній шов; BS: нижній шов MS верхній шов TS) Хірургічна зона знаходиться в нижньому кінці фігури (овальна форма), а розміщення шва позначено чорними лініями. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

індукція
Малюнок 2: TTC - Забарвлення відділів мозку. Верхня панель представляє типове забарвлення після фіктивного вставлення. Після 60-хвилинної MCAO отримували 90 хвилин або 24 години реперфузії середньої та нижньої пластин. Шкала ваги 1 мм.

3 "src ="/files/ftp_upload/54805/54805fig3.jpg "/>Малюнок 3: Післяінсультне імунофлюоресцентне фарбування мозку миші. Після 60-хвилинної оклюзії мозок збирали протягом 23 годин і обробляли для реперфузійного кріорізання. За допомогою антитіл проти MAP2 (вгорі) та GFAP (внизу) тканину аналізували на ураження нейронів та астрогліоз або підставних (ліві поля), або 90-хвилинної ішемії-реперфузійного мозку (права поля). Представлені зображення беруться з декількох зображень, об'єднаних конфокальною мікроскопією з використанням об'єктива 10X. Шкала ваги 1 мм. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

Таблиця 1. Вимірювач для оцінки миші - Стан та нейродефіцит після інсульту. Відкориговано з 1, 2.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Залежно від досвіду користувача, цей метод може бути використаний з високою пропускною здатністю для обстеження великої групи тварин. Статистична значимість досліджень на тваринах залежить від використання достатньої кількості пацієнтів між групами лікування, незважаючи на визнання внутрішніх відмінностей між експериментальними тваринами. Представлений протокол дозволяє проводити такі дослідження, одночасно ретельно відтворюючи частини процесу захворювання.

Перевага методики MCAO полягає в тому, що, хоча вона включає деякі хірургічні процедури, вона не вимагає дуже інвазивних процедур, як у моделі краніотомії. Крім того, він дуже відтворюваний, а реперфузія є керованою, що неможливо ні з ендотеліном-1, ні з емболічним інсультом. Ця техніка імітує процес ішемічного інсульту людини і утворює травми, характерні для тканин, що спостерігаються у людини, що не стосується моделі фототромбозу. Порівняно з іншими опублікованими методиками, процедура MCAO не вимагатиме припікання ЕКА. Це є перевагою, оскільки її можна поєднувати з нашою моделлю інфузії ICA для доставки терапевтичних засобів до ураженої півкулі після індукції інсульту 23, 24, 25.

На додаток до аналізу тканин, поведінку тварин можна контролювати подовгу, щоб оцінити тяжкість інсульту та відновлення. Це може допомогти порівняти відновлення між різними групами лікування. Для оцінки поведінки було розроблено кілька підходів. Проста 5-бальна шкала може бути використана для оцінки неврологічного дефіциту після інсульту (0: відсутність дефіциту поведінки; 1: відсутність контралатеральної розгинання передньої лапи; 2: кружляння на протилежній стороні інфаркту; 3: пастки на протилежній стороні інфаркту; 4: Низький рівень свідомості та спонтанних рухів) 5. Крім того, можна провести поглиблений аналіз стану та поведінки тварини, щоб оцінити одужання як 2 в Таблиця 1 1 описано.

Представлена ​​хірургічна процедура використовує механічний метод індукції інсульту, який обмежує використання цієї техніки у дослідженнях чутливості до інсульту та/або патогенних мікроорганізмів. Однак цей протокол може бути надзвичайно корисним для аналізу тяжкості інсульту, стратегій його уникнення або обмеження, обтяжуючих факторів та можливих терапевтичних підходів після інсульту. Порівняння між групами лікування може допомогти визначити потенційні методи лікування, які можуть мінімізувати пошкодження інсульту або пришвидшити відновлення. Дійсно, допомога хворим на інсульт покращити одужання була б дуже важливою.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.