Кількісна оцінка атеросклерозу у мишей (переклад на французьку)
Резюме
Мишачі моделі атеросклерозу є корисними інструментами для вивчення патогенних шляхів на молекулярному рівні, але вимагають стандартизованої кількісної оцінки розвитку ураження. Цей протокол описує оптимізований метод визначення розміру ураження у великих артеріальних судинах, включаючи корінь аорти, дугу аорти та брахіоцефальну артерію.
Анотація
Серцево-судинні захворювання є основною причиною смерті у всьому світі. Основною причиною в більшості випадків є атеросклероз, який частково є хронічним запальним захворюванням. Експериментальні дослідження атеросклерозу з’ясували роль холестерину та запалення в процесі захворювання. Це призвело до успішних клінічних випробувань з фармацевтичними препаратами, що зменшують клінічні прояви атеросклерозу. Ретельні та добре контрольовані експерименти на мишачих моделях захворювання можуть додатково з’ясувати патогенез захворювання, який до кінця не вивчений. Стандартизований аналіз уражень важливий для зменшення експериментальної мінливості та підвищення відтворюваності. Визначення розміру ураження в корені аорти, дузі аорти та брахіоцефальній артерії - загальні кінцеві точки експериментального атеросклерозу. Цей протокол надає технічний опис для оцінки атеросклерозу в усіх цих місцях в одній миші. Протокол особливо корисний, коли матеріал обмежений, як це часто буває, коли характеризуються генетично модифіковані тварини.
Вступ
Серцево-судинні захворювання є головною причиною смерті у всьому світі, причому ішемічна хвороба серця та інсульт становлять кожну четверту смерть Більшість випадків спричинені атеросклерозом, захворюванням, що характеризується повільним накопиченням бляшок, навантажених ліпідами, з ознаками хронічного запалення у великих та середніх артеріях 2. Захворювання зазвичай залишається непоміченим протягом декількох десятиліть, поки розрив або ерозія нальоту не спричиняє тромбоз артерій, що призводить до ішемічного пошкодження тканин.
Нормальна артерія складається з шару інтими з погано розподіленими ендотеліальними клітинами та клітинами гладкої мускулатури, шару середовища з гладком'язовими клітинами та еластичними пластинками та навколишнього адвентиціального шару з пухкою сполучною тканиною 3. Затримка LDL в інтимі компенсує розвиток атеросклерозу 4. Накопичення та модифікація ліпопротеїнів призводить до агрегації та захоплення в артеріальній інтимі 5. Запальну реакцію викликають захоплені та модифіковані ліпопротеїни 6. Ендотеліальні клітини починають експресувати молекули адгезії, такі як VCAM-1, в місцях в артеріальному дереві з турбулентним кровотоком, що призводить до набору циркулюючих моноцитів та інших лейкоцитів. 8 .
Атеросклероз вивчався на моделях мишей із збільшенням частоти з середини 1980-х рр. C57BL/6 є найбільш часто використовуваним інбредним штамом миші для цих досліджень і використовується в якості генетичного фону в більшості випадків. Генетично модифіковані штами 9. Цей штам був створений у 1920-х рр. 10, а його геном опублікований у 2002 р. 11. Експерименти на мишачих моделях мають ряд переваг: колонії швидко розмножуються, житло економить місце, а інбридинг зменшує експериментальну мінливість. Модель також дозволяє проводити генетичні маніпуляції, такі як цілеспрямовані делеції генів та інсерція трансгенів. Це призвело до нового патофізіологічного розуміння захворювання та нових цілей терапії 12 .
Миші дикого типу C57BL/6 природно стійкі до атеросклерозу. У них більша частина холестерину циркулює в ЛПВЩ, а складні атеросклеротичні ураження не утворюються навіть при харчуванні з високим вмістом жиру та холестерину 13. Тому гіперхолестеринемічні миші, такі як Apoe -/- на фоні c57BL/6, використовуються як експериментальні моделі атеросклерозу 14, 15. Відсутність ApoE погіршує печінкове засвоєння решти ліпопротеїдів і суттєво порушує ліпідний обмін. У мишей Apoe -/- циркулюючий холестерин в основному знаходиться в частинках ЛПНЩ, і миші розвивають складні атеросклеротичні бляшки при регулярному харчуванні чау.
Ldlr -/- миші імітують розвиток атеросклерозу, який спостерігається у людей із сімейною гіперхолестеринемією 16. Мишам Ldlr -/- потрібна дієта західного типу для розвитку атеросклерозу 17. Західна дієта імітує споживання їжі людиною і зазвичай містить 0,15% холестерину. Рецептор LDL розпізнає apoB100 та ApoE та опосередковує надходження частинок LDL шляхом ендоцитозу. Рецептори ЛПНЩ мають фундаментальне значення для очищення печінки ЛПНЩ від кровообігу, тоді як експресія рецепторів ЛПНЩ у гемопоетичних клітинах не впливає на цей процес. Це відкриває можливість для трансплантації Ldlr кісткового мозку -/клітин при Ldlr гіперхолестеринемії -/- реципієнтів та оцінки розвитку атеросклерозу. Химери кісткового мозку широко використовуються для вивчення участі гемопоетичних клітин в експериментальному атеросклерозі. Однак трансплантація кісткового мозку може впливати на розмір і склад атеросклеротичних бляшок, роблячи тлумачення результатів неоднозначним.
Для вивчення конкретних процесів захворювання розроблені різні варіанти мишей Apoe -/та Ldlr -/- з іншими генетичними змінами 18. Прикладом є людські APOB100-трансгенні миші Ldlr -/- (HuBL), які несуть людський ген APOB100 людини 19, 20. Ці миші розвивають високий рівень холестерину та атеросклероз на регулярній дієті чау. Однак розвиток складних атеросклеротичних бляшок займає щонайменше шість місяців, і в коротших експериментальних протоколах зазвичай використовується дієта Western 21. Велика частка холестерину в плазмі циркулює в частинках ЛПНЩ, що надає мишам HuBL дисліпідемічний ліпопротеїновий профіль. Більше людини, ніж Апое -/- і Ldlr -/- миші Миші HuBL також дозволяють досліджувати апоВ людини як аутоантиген 22 .
На мишачих моделях атеросклерозу розвиваються складні атеросклеротичні бляшки зі спільними ознаками захворювання людини. Однак бляшки досить стійкі до розриву з наступним інфарктом міокарда. Атеротромоз виявляється лише епізодично і експериментально важко оцінити 23, 24, 25. Розроблено спеціальні моделі розриву нальоту, але експериментальне поле не має надійної та відтворюваної моделі для оцінки стабілізуючих речовин нальоту.
Кількісне визначення атеросклерозу багато в чому повідомляється в літературі. Недавні зусилля намагалися стандартизувати експериментальну розробку, виконання та звітування про дослідження на тваринах 26. Дослідники мають різні уподобання та методи, придатні для їх лабораторій. Більшість дослідницьких проектів також унікальні таким чином, що вимагають модифікацій протоколу. Через багатофакторний характер захворювання, оптимальний контроль залежить від проекту до проекту. Місцеві умови та відсутність нормалізації можуть призвести до виявлених відмінностей у розвитку хвороби, перешкоджаючи прогресу в галузі досліджень. Відмінності в експериментальній мінливості також означають, що статистичні розрахунки потужності повинні базуватися на пілотних дослідженнях у місцевих умовах.
Кількісна оцінка атеросклерозу рекомендується в кількох місцях на судинному дереві. Цей протокол описує, як отримати результати кореня аорти, дуги аорти та брахіоцефальної артерії у однієї миші, на додаток до того, що решта грудно-черевної аорти залишається для подальшого аналізу. Препарати для обличчя дозволяють швидко визначити навантажені бляшками ліпідів в дузі аорти. Навантаження хвороби в брахіоцефальній артерії також можна визначити кількісно, якщо ретельно виставляти зразки. Більш довгий виріз кореня аорти залишає кілька ділянок для детальної оцінки складу нальоту.
Протокол
Усі експерименти на тваринах повинні бути схвалені етичними органами.
1. Мишача жертва та мікродисекція аорти
2. Аналіз обличчя дуги аорти та брахіоцефальної артерії (uk)
Рисунок 2: Кількісна оцінка аросклеротичних уражень. (AT) Дуга аорти 20-тижневого самця APOB100-трансгенної Ldlr -/- (HuBL) миші, яку годували західною дієтою протягом десяти тижнів, прикріплювали і фарбували на багаті ліпідами бляшки Суданом IV. Загальна площа дуги аорти описана пунктирною лінією білого кольору на мікрофотографії, шкала шкали 2 мм. Пунктирними лініями жовтого кольору описується загальна площа брахіоцефальної артерії. () Переріз кореня аорти на відстані 400 м від синуса аорти у 20-тижневого самця Ldlr -/- миші, яку годували західною дієтою протягом восьми тижнів, візуалізували на мікрофотографії, шкала 500 м. Пунктирними лініями чорним кольором описується загальна площа судини та атеросклеротичні ураження, пофарбовані червоним маслом О, розташовані в артеріальній інтимі. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
3. Кріосекція кореня аорти
Рисунок 3: Розташування слайдів для серійних зрізів кореня аорти. Під час кріосекції кореня аорти слід зібрати всі ділянки товщиною 10 м, що охоплюють перші 800 м висхідної аорти. Систематична організація слайдів необхідна для отримання відповідних розділів для різних застосувань. Аналіз складу ураження, як правило, включає O-червону пляму для ліпідів та Picrosirius-червону пляму для колагену. Решта зрізи об’єднують і фіксують ацетоном для імуногістохімії та імунофлюоресцентного фарбування. Ця цифра була змінена з Gister et al 30. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
4. Забарвлення червоної олії і кількісне визначення атеросклерозу в коренях аорти
Репрезентативні результати
Red O Oil - це жиророзчинний яскраво-червоний діазо-барвник, який забарвлює нейтральний жир. Полярні ліпіди в клітинних мембранах не фарбуються. Масляно-червоне фарбування O можна проводити на свіжих, заморожених або закріплених у формаліні зразках, але не на зразках, включених у парафін через видалення ліпідів у процесі необхідної депарафінізації. Кількісна оцінка накопичення ліпідних уражень може бути виконана шляхом виділення позитивної зони червоного масла O від загальної поверхні ураження (Рисунок 4C). Гематоксилін утворює синю пляму ядер клітин, що корисно для візуалізації морфології нальоту. Права та ліва коронарні артерії зазвичай відходять від аорти приблизно на 250 м від аортального синуса 27, що часто збігається з найбільшими розмірами ураження. Поперечні зрізи цієї області часто відображаються як репрезентативні результати (рис. 4D).
Червона олія O може бути використана для фарбування підготовлених аорт спереду, але в цьому протоколі використовується Судан IV, інша зручна жиророзчинна діазо-пляма. Судан IV чітко візуалізує атеросклеротичні бляшки оранжево-червоного кольору шляхом боротьби з ліпідами, тригліцеридами та ліпопротеїнами. Видалення темного тла на репрезентативних зображеннях протилежних дуг аорти може покращити візуальне відображення (рис. 5А). Зазвичай розмір ураження зазвичай поділяють на групи, що дозволяє проводити статистичне тестування за допомогою тесту студента між групами. Точковий графік, який показує як окремих мишей, так і середнє значення, яке порівнюється між групами, є інформативним способом відображення результатів (Малюнок 5B-C). Оскільки варіація в межах груп, як правило, відрізняється між місцями на судинному дереві, як правило, необхідні окремі розрахунки потужності. Зайвих варіацій можна уникнути за допомогою навичок методів та стандартизації протоколів. Важливо отримати статистично значущі результати, але завжди слід враховувати біологічну значимість спостережуваної різниці.
Рисунок 5: Атеросклеротичні ураження дуги аорти та брахіоцефальної артерії. (AT) На фотографіях мімічних знімків дуг аорти зафіксовані суданські IV забруднені ліпідними бляшками (оранжевого кольору) від 20-тижневих мишей, яких годували західною дієтою протягом десяти тижнів, візуалізували разом. 2 мм шкала. В якості контролів використовували мишей Ldlr -/- (HuBL), а експериментальну групу складали трансгенні миші TCR з реактивними Т-клітинами LDL (BT1), які перейшли до мишей HuBL. () Атеросклеротичні ураження в дузі аорти (HuBL n 10, BT1xHuBL n 12; t-тест Стьюдента). (VS) Атеросклеротичні ураження в брахіоцефальній артерії (HuBL n 8, BT1xHuBL n - 9, t-тест Стьюдента). (-VS) Крапки представляють окремих мишей, стовпчики мають середнє значення 'SEM. 'p' 0,05. Ця цифра була змінена з Gister та співавт. 32. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Додатковий малюнок 1: Альтернативна організація слайдів для послідовних зрізів кореня аорти. Спрощена систематична організація слайдів для збору зрізів коренів аорти. Колекція дозволяє фарбувати маслом Red O для ліпідів та імуногістохімічним або імунофлуоресцентним фарбуванням. Спеціальні слайди для фарбування червоним колагеном Picrosirius опущені. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.
Обговорення
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Ми дякуємо всім колишнім членам експериментального відділу досліджень серцево-судинної системи Гарана К. Ханссона, які сприяли розробці цього протоколу за останні чверть століття. Ми особливо вдячні за внески Антоніно Ніколетті, Сінхуа Чжоу, Анни-Карін Робертсон та Інгер Бодін. Ця робота була підтримана грантом проекту 06816 та підтримкою Ліннея 349-2007-8703 Шведської дослідницької ради та грантами Шведського фонду серцевих легенів, Ради округу Стокгольм, Фонду професора Нанні Сварц, Лоо та Ганса Остермана. Фонд медичних досліджень, Науковий фонд Каролінського інституту та Фонд геріатричних хвороб Інституту Каролінської.