Кількісний раціометричний датчик для часового аналізу динаміки

датчик

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • Розробка, оцінка та оптимізація датчиків у системі клітин ссавців
  • Характеристика та застосування раціометричного ауксинового датчика в рослинних клітинах
  • Обговорення
  • Методи
  • Плазмідна конструкція
  • Культура клітин ссавців, трансфекція та лікування ауксином
  • Рослинний матеріал
  • Виділення протопластів, трансформація та переробка ауксину
  • Аналіз трансгенної експресії
  • Індуктори
  • Аналіз люмінесценції
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • коментарі

Теми

  • В
  • Біологічні методи
  • Молекулярна інженерія в рослинах
  • Сигнальна фабрика

Анотація

Кількісний аналіз опосередкованих ауксином процесів у рослинних клітинах досі обмежений. Застосовуючи синергетичний підхід до синтетичної біології ссавців та рослин, ми розробили новий співвідносний біосенсор світло-світло, широко застосовуваний для вивчення метаболізму, транспорту та сигналізації ауксину. Чутливість та кінетичні властивості нашого генетично кодованого біосенсора відкривають нові перспективи для аналізу надзвичайно складної динаміки ауксину у рості та розвитку рослин.

вступ

Щоб задовольнити ці вимоги, ми розробили хемілюмінесцентний раціометричний датчик із використанням взаємодії, опосередкованої ауксином, між TIR1 та Aux/IAA. Застосовуючи датчик, що базується на деградації, в перехідній системі клітинної експресії генів, наприклад протопластах, очікується висока тимчасова роздільна здатність. Крім того, люмінесцентні репортери забезпечують високі співвідношення сигнал/шум і, отже, високу чутливість, а також необхідний широкий динамічний діапазон 13, 14. Нарешті, проведення раціометричних кількісних оцінок сприяє надійності інструменту шляхом виправлення відмінностей, характерних для клітин, або мінливості, типової для перехідних аналізів 15 .

Результати

Розробка, оцінка та оптимізація датчиків у системі клітин ссавців

Щоб відповідати специфікаціям, описаним для раціометричного ауксинного датчика, ми розробили синтетичну конструкцію, що включає люциферазу світлячка, злиту з залежною від ауксину послідовністю деградації/елементом білків Aux/IAA (сенсорний модуль) та люцилазу нирки (нормалізуючий елемент) (конструкція датчика Рис. 1а). Ці два компоненти пов’язані пептидом 16 2А, що призводить до їх стехіометричної коекспресії, що дозволяє контролювати деградацію сенсора, залежного від ауксину, у формі зменшення світлячка проти люмінесценції ренілу (F/R) (рис. 1а).

Тому ми скористалися описаними характеристиками білків Aux/IAA для раціонального проектування сенсорних модулів: i) з різних білків Aux/IAA була розроблена серія синтетичних модулів сенсорів для отримання сенсорів з різним динамічним діапазоном ауксину чутливість; ii) з метою мінімізації потенційних перешкод датчика з ендогенними сигнальними компонентами ауксину використовували лише 13 амінокислотних мінімальних дегронних послідовностей різних білків Aux/IAA.

Відповідно, ми використовували в якості сенсорних модулів 13-амінокислотні послідовності трьох різних Aux/IAA, що охоплюють широкий діапазон чутливості, а саме AtIAA17, AtIAA28 і AtIAA31, зі спорідненістю до зв'язування ауксину 33 нМ, 75 нМ і> 1000. нМ, відповідно 10. Мінімальна послідовність дегронів з 13 амінокислот AtIAA17 збігається з чутливою до амінокислот консенсусною послідовністю, чутливою до ауксину, з 22 білків Aux/IAA 18 (QVVGWPPVRSYRK, датчик min17-Luc, Додаткова таблиця 1), тоді як послідовності AtIAA28 та AtIAA31 значно відхиляються (PVVGWPPVRSSRR та ARQDWPPIKSRLR, що генерують датчики min28-Luc та min31-Luc відповідно, Додаткова таблиця 1). Конструкція без модуля датчика служила негативним контролем системи (Ctrl-Luc, конструкція управління, Додаткова таблиця 1).

(а) Початкова характеристика вибраних варіантів датчиків у протопластах А. таліана. Через 24 год після трансформації протопласти, що експресують FL-Luc, L2min17-Luc або Ctrl-Luc, інкубували протягом 5, 15 або 45 хвилин у середовищі без гормонів або з комплектом ауксину (1 мкМ IAA). Раціометрична активність люциферази представлена ​​як середнє значення ± sem (n = 6). Наведено статистичні значення (двосторонній t-тест, * P 10, 23. Що примітно, крім своєї високої чутливості та реактивності, датчик консенсусної послідовності здатний розрізняти різні аналоги ауксину, тим самим виявляючи його потенціал як інструменту для вивчення метаболізму, транспорту та сигналізації фізіологічно активних сполук.

Обговорення

Кількісний моніторинг ауксину в живих клітинах виявився складним. Використовуючи раціометричну люмінесцентну репортерну систему, ми змогли розробити біосенсор на основі деградації для одноклітинних систем, відповідаючи високим вимогам чутливості та часової роздільної здатності, необхідним для вивчення складних процесів, опосередкованих ауксином. З цією метою ми застосували синергетичний підхід синтетичної біології, що включає розробку та попередню характеристику датчика в безперешкодній гетерологічній системі клітин ссавців з подальшим успішним застосуванням у рослинних клітинах.

В даний час для кількісного визначення ауксину 3, 4 доступна низка непрямих та прямих аналітичних методів, починаючи від радіомаркірування, аналізу мікроелектродами до ГХ-МС у поєднанні з сортуванням клітин, що активується флуоресценцією. Ці підходи є дуже чутливими та точними, але в той же час мають внутрішні недоліки, такі як необхідність руйнувати клітини або тканини, часто складні та виснажливі процедури підготовки, розриви або великі витрати на обслуговування та експлуатацію обладнання. На додаток до високої чутливості та селективності цих інструментів, описаний тут генетично кодований люмінесцентний біосенсор ауксину дає можливість кількісного моніторингу динаміки ауксину в живих клітинах із часовим дозволом. Крім того, сенсорна аналітична платформа є технічно простою, вимагає лише відносно низької вартості пристрою для зчитування люмінесцентних пластин, і тому цей підхід можна легко встановити в лабораторії досліджень рослин.

Представлений тут датчик поділяє свій принцип роботи з біосенсором ауксину DII-Venus. Два датчики засновані на утворенні ауксинозалежного комплексу типу TIR1/AFB-Aux/IAA. Хоча датчик DII-Venus забезпечує неперевершену просторово-часову оцінку реакцій ауксину у Planta 8 з високою роздільною здатністю, наш інструмент оптимізований для використання в одноклітинних системах. Він поєднує люмінесцентний репортер з елементом внутрішньої нормалізації, що дозволяє виконувати надзвичайно чутливі та більш точні кількісні визначення, як описано в цій роботі. Отже, додаткові характеристики двох підходів можуть бути використані синергетично для переваги більш повних досліджень динаміки ауксину в рослинах.

Тут ми ілюструємо більший потенціал цього нового ауксинового датчика, який у поєднанні з іншими доступними молекулярно-генетичними методами та інструментами, такими як мутанти, підходи RNAi, аналоги та інгібітори, створить кількісні бази даних, необхідні для всебічного розуміння мереж гомеостазу та сигналізації. . Крім того, люмінесцентний біосенсор у поєднанні з платформою рослинних клітин підходить для аналізів у форматі багато лунок, що дозволяють проводити динамічний аналіз при середній та високій пропускній здатності на генетичних та хімічних екранах.

Чудові кінетичні та чутливі властивості нашого генетично кодованого біосенсора, поряд з його високою придатністю та універсальністю, не лише покращують наявні в даний час методи визначення ауксину, але також пропонують нові перспективи. Крім того, адаптація цієї системи до аналізу інших гормонів, що мають спільний протеолітичний механізм, індукований гормонами, таких як жасмонова кислота та гібереліни 1, відкриває нові перспективи досліджень у галузі рослинних гормонів.

Методи

Плазмідна конструкція

Різні сенсорні конструкції були отримані шляхом злиття ампліконів, генерованих за допомогою ПЛР, у вектор експресії ссавців TOPO-pEF5 (Invitrogen, США). Люциферази реніли та світлячка ампліфікували з плазмід pRL-TK (Promega, US) та pGL3-basic (Promega, US), відповідно. Консенсусні послідовності мінімальної деградації та всі лінкери були введені в праймери ПЛР. Плазміда pNHK60, що включає кДНК AtAUX/IAA17 (GeneID839568) та OsTIR1 (GeneID3435696), була люб’язно надана М. Канемакі з Університету Осаки, Японія. Відповідні амінокислотні послідовності всіх компонентів датчика наведені в Додатковій таблиці 1. Для побудови векторів експресії рослин різні конструкції датчиків були рекомбіновані у сумісний двійковий вектор pMIR Шлюз 28, отриманий з вектора експресії pAM-PAT. (Приєднання до GenBank AY436765.1). Для спільної експресії AtAUX1 (GeneID818390), AtPIN1 (GeneID843693) або GFP, відповідні послідовності кДНК були введені шляхом клонування шлюзу у вектори pMIR, що містять конструкцію L2min17-Luc. У всіх випадках експресію гена визначали за допомогою промотору CaMV 35S.

Культура клітин ссавців, трансфекція та лікування ауксином

Рослинний матеріал

Насіння A. thaliana (Col-0) висівали в рядку на смужки автоклавного фільтрувального паперу (200–300 насіння/смужка), розміщені на квадратних пластинах розміром 12 см (Greiner Bio-One, Німеччина), що містять середовище. Культура SCA 30. Через 24 години інкубації при 4 ° С пластини поміщали в камеру росту з 16-годинним світловим режимом при 21 ° С. Для виділення протопластів використовували 2-3-тижневі саджанці.

Виділення протопластів, трансформація та переробка ауксину

Аналіз трансгенної експресії

Через 20 год після трансформації 1 * 10 6 протопластів для кожної конструкції збирали центрифугуванням та використовували для виділення РНК за допомогою міні-набору RNeasy plant (Qiagen, Німеччина), згідно з інструкцією з виготовлення, з додатковою обробкою до ДНКази. Для RT-PCR рівну кількість очищеної РНК використовували для синтезу кДНК з зворотною транскриптазою Maxima (Fermentas, Німеччина) з праймерами oligodT, потім для реакції ПЛР з праймерами 5′-ggtggtggtcggaactctaa та 5′-tagcaggaccacct ) для AtPIN1. 5′-ttgggttcggggggggggct та 5′-aagcggcgaccggggggcatgt для AtAUX1, та 5′-tggaccgctcttacaagg та 5′-cttgaggggggggggcacaagga для AtPEX4. Рівні кількості кожної реакції завантажували в 2% агарозний гель.

Індуктори

Індол-3-оцтову кислоту (IAA) (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) готували як 57 мМ резист у 95% етанолі. 1-нафтилоцтову кислоту (NAA) купували у вигляді стерильних 5,37 мМ вихідних розчинів (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). 2,4-дихлорфеноксиуксусну кислоту (2,4-D) (Duchefa Biochemie, Нідерланди) готували у вигляді 200 мМ вихідного розчину в 95% етанолі. 2-нафтилоцтову кислоту (2-NAA) (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) готували у вигляді 200мМ вихідного розчину в 1М NaOH.

Аналіз люмінесценції

Для визначення активності люциферази клітини ссавців спочатку лізували, додаючи 250 мкл буфера лізису люциферази (25 мМ Tris-HCl, рН 7,8, Triton X-100 до 1%, 4 мМ MgSO 4, 1 мМ DTT) на лунку та інкубацію при 4 ° C протягом 10 хв. 80 мкл лізату клітин ссавців переносили на білу пластину з рівним дном Costar® 96 (Corning Incorporated, Німеччина). Після зазначеного часу інкубації 80 мкл суспензій протопластів використовували безпосередньо для визначення люмінесценції. Люмінесценцію Firefly та Renilla контролювали безпосередньо за допомогою багаторежимного зчитувача мікропланшетів Synergy 4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT) або зчитувача люмінесценції Mithras LB940 з вбудованими інжекторами (Bertold Technologies, Німеччина) після додавання 20 мкл люциферази світлячка субстрат (20 мМ трицину, 2,67 мМ MgSO 4, 0,1 мМ ЕДТА, 33,3 мМ DTT, 0,52 мМ АТФ, 0,27 мМ ацетил-КоА, 5 мМ субстрату NaHC, 47 мМ люциферин) або субстрат люцилази нирки (472 мкМ), розчин у метанолі; розведений безпосередньо перед використанням, 1:15 у PBS).

статистичний аналіз

Односторонній ANOVA або t-тест проводили з Matlab 7.120.635 (R2011a). Відповідні значення р вказані в легендах рисунків.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Умов обслуговування та рекомендацій спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як невідповідне.