Клінічне застосування бактеріальної геноміки та метагеноміки та медичне значення - Огляд
резюме
Нові технології секвенування дозволяють швидко і доступно отримувати геномні послідовності для таких програм, як а) розробка діагностичних ПЛР або серологічних тестів; b) виявлення факторів вірулентності та генів стійкості до антибіотиків; і c) епідеміології патогенних бактерій. Таким чином, бактеріальна геноміка корисна мікробіологам, інфекціоністам та спеціалістам з гігієни лікарні. Визначення мікробного складу зразка, що називається метагеномікою, є ще одним застосуванням нових технологій секвенування. Дослідження мікробіоти людини корисно для розуміння впливу бактерій на ожиріння, астму чи діабет. Метагеноміка, швидше за все, стане спеціалізованим діагностичним аналізом.
Вступ
Секвенування, що дає можливість визначити сукцесію нуклеотидних основ в ДНК, революціонізувало наукові дослідження. У 1977 р. Сангер та співавт. секвенував перший геном бактеріального вірусу (ΦX174) шляхом ферментативного синтезу. 1 Відтоді значні технічні вдосконалення дозволили появу нових так званих технологій секвенування з високою пропускною здатністю (NTS) (табл. 1). Ці NTS значно збільшили швидкість послідовності і одночасно знизили її вартість. Зовсім недавно були випущені моделі більш компактних секвенсорів, таких як Roche/454 GS Junior, Illumina MiSeq або Ion torrent PGM. 2 Менш дорогі, але менш продуктивні, проте вони мають достатній потенціал для діагностичних лабораторій бактеріології, враховуючи розмір геномів бактерій (приблизно в 1000 разів менший за геном людини). Використання високопродуктивних секвенсорів призвело до експоненціального збільшення кількості секвенсованих бактеріальних геномів (рис. 1). Таким чином, 98% з 26 000 наявних в даний час геномів були секвенувані протягом останніх семи років. Дані про мікробні спільноти також швидко зростають завдяки метагеномічним підходам.
Порівняльна таблиця різних технологій послідовності з високою пропускною здатністю
Порівняльна таблиця різних технологій послідовності з високою пропускною здатністю
Геноміка або метагеноміка: як розпочати ?
Бактеріальна геноміка, що дозволяє вивчати бактеріальні геноми (їх будову, еволюцію, функцію закодованих генів та їх регуляцію), в основному базується на виділенні та культурі даної бактерії. Отримання чистої культури є важливим етапом у зв'язку певного фенотипу штаму бактерій із вмістом його генів, зокрема для конкретного вивчення його вірулентності, патогенності або стійкості.
Однак переважну більшість бактерій (понад 99%) не можна культивувати. 3 Таким чином, для вивчення бактеріального співтовариства в цілому тепер можна послідовно аналізувати ДНК всіх бактерій, що знаходяться в певному середовищі (ґрунт, вода, травний тракт людей і тварин, клініки зразків…). Цей підхід, який називається "метагеноміка", говорить нам про різноманітність та відносну кількість мікроорганізмів.
Як проілюстровано на фіг.2, секвенування повного генома бактерії або метагеномне секвенування здійснюється у чотири основні етапи: а) екстракція геномної ДНК або з чистої бактеріальної культури, або безпосередньо з зразка; b) секвенування ДНК із попередньою ампліфікацією або без неї; c) біоінформатична збірка секвенуваних геном (-ів) та d) аналіз отриманих послідовностей.
Різні стадії секвенування бактеріального геному
Застосування геноміки в клінічній мікробіології
У галузі медицини з’являються нові застосування НТС (табл. 2), такі як: розробка більш ефективних засобів молекулярної діагностики, поглиблене дослідження епідемій, вивчення патогенності штаму бактерій, а також виявлення факторів вірулентності (вірулома) або генів, що кодують стійкість до антибіотиків (резистом). 4,5 NTS підходи дозволяють всебічно проаналізувати мікроорганізм, про який йде мова, і надалі забезпечать ці результати так само швидко, як і звичайні методи.
Приклади клінічного застосування за допомогою використання нових технологій секвенування (NTS)
Розробка засобів молекулярної діагностики
Розширення NTS дозволило розробити інструменти для профілактики та діагностики бактеріальних інфекцій, включаючи чутливі та специфічні ПЛР. 6–8 Отже, Ян та ін. розробив ПЛР широкого спектру, заснований на геномному порівнянні 27 штамів Acinetobacter baumannii, з метою покращення нагляду за клональними та патогенними штамами цього виду бактерій. 6 Нещодавно ми виявили поліморфний штам менінгококів (Neisseria meningitidis), який не виявляється за допомогою діагностичної ПЛР, що застосовується у CHUV. 9 Порівняння генів цього штаму з генами 183 інших доступних штамів N. meningitidis дозволило ідентифікувати одинадцять генів-мішеней та розробити діагностичні ПЛР, специфічні для виду N. meningitidis. 10
Корисність швидкого геномного аналізу також була продемонстрована в останніх епідеміях. 8,11,12 Таким чином, під час спалаху Е. ентерогеморагічна паличка O104: H4, геноміка дозволила за кілька днів ідентифікувати регіони геному, унікальні для цього штаму, які можуть бути націлені за допомогою специфічної діагностичної ПЛР. 11 Іншим прикладом є шведський штам Chlamydia trachomatis, який уникнув більшості комерційних ПЛР. Послідовність його геному виявила делецію 377 bp на рівні криптичної плазміди, області, спеціально націленої на ПЛР, що використовувались до того часу. 12
Розробка серологічних інструментів
Геномна послідовність також дозволяє отримати каталог білків, кодованих бактерією (протеомом). Цей теоретичний каталог у поєднанні з аналізом імуногенних білків за допомогою мас-спектрометрії дозволяє розробляти серологічні засоби. 13,14 Нещодавно Kebbi et al. застосував комбінований геномічний та протеомічний підхід до Waddlia chondrophila, внутрішньоклітинної бактерії, пов’язаної з хламідіями, яка пов’язана з викиднем у людей та абортами у жуйних. 13,15 У цьому дослідженні виявлено імуногенні білки та запропоновано новий серологічний тест для діагностики цього збудника. 13
Стійкість до антибіотиків
Резистентність до антибіотиків сьогодні є глобальною проблемою охорони здоров’я. Дійсно, мультирезистентні до антибіотиків бактерії (BMR) отримують все більше і більше поширення. 16,17 У 2007 р. В Європі від BMR було спричинено 400 000 інфекцій, що призвело до 25 000 смертей через відсутність ефективних антибіотиків. 17
У цьому контексті НТС є важливим засобом для розуміння різних механізмів стійкості, їх генетичної основи та їх міжконтинентального розповсюдження. Таким чином, вивчення геномів мультирезистентних патогенів дозволило краще описати основні способи передачі детермінант резистентності через обмін рухливими генетичними елементами, особливо у клінічних ізолятах ентеробактерій, A. baumannii та синьогнійна паличка. 16,18 Ці мобільні генетичні елементи, що іноді кодують кілька генів стійкості до антибіотиків та важких металів, дозволяють цим BMR зберігатись в лікарняних умовах та протистояти майже всім загальнопризначеним антибіотикам. 17
Послідовність та аналіз геномів цих бактерій дозволили виявити та розробити інструменти молекулярного моніторингу для основних проблемних генів стійкості, таких як кодуючі бета-лактамази широкого спектру (ESBL, такі як TEM-24), карбапенемази як KPC, VIM, NDM, OXA-23, OXA-24), присутній у грамнегативних паличках, а також ген mecA, що кодує стійкість до метициліну у стафілококів. 19–21 Крім того, збільшення доступних геномних послідовностей сприяло створенню баз даних, вільно доступних в Інтернеті, що дозволило швидку ідентифікацію генів стійкості, виявлених під час секвенування патогена. 22–25 Швидке виявлення цих факторів стійкості дозволяє запобігати епідеміям, обмежуючи масове розповсюдження цих генів, призначаючи більш відповідне лікування та обмежуючи витрати на лікування та госпіталізацію.
Епідеміологія та поширення мультирезистентних бактерій
Структури лікарень часто стикаються з бактеріальними епідеміями, спричиненими внутрішньолікарняними збудниками, такими як метицилін-стійкий золотистий стафілокок (MRSA), BMR, що складаються в основному з ентеробактерій (Klebsiella pneumoniae, E. coli, Enterobacter cloacae та ін.), А також неферментативних паличок, таких як А. baumannii та P. aeruginosa. 26–30 Кілька досліджень повідомляють про використання NTS як інструменту розслідування для розуміння поширення штамів у лікарні, регіоні чи навіть континенті. 31–34
У 2012 р. Фогель та співавт. повідомили про використання NTS для вивчення та розуміння стійкості та поширення клонального штаму S. aureus ST228 у CHUV протягом десятирічного періоду. 35 Секвенування та геномне порівняння восьми штамів S. aureus, виділених між 2001 і 2008 роками, продемонстрували генетичні зміни, такі як отримання плазміди, втрата великого геномного фрагмента та інсерції транспозаз. У 2013 р. Lavezzo et al. вивчав спалах N. meningitidis, що характеризується високим рівнем смертності на північному сході Італії. Хоча розслідування цієї епідемії за допомогою звичайних методів, таких як молекулярне типізування (MLST), електрофорез з імпульсним полем (PFGE) та серологічні тести прийшли до висновку, що був випущений той самий клон N. meningitidis ST-11, послідовність та геномне порівняння деяких штами виявили геномні відмінності та придбання генів, що суттєво сприяло патогенності цих штамів. 31
Бактеріальна метагеноміка
Термін "метагеноміка" вперше був використаний Handelsman та співавт. в 1998 р. 36 Однак лише завдяки досягненням НТС тепер можна вивчати мікробне різноманіття будь-якої проби. Цей підхід також дозволяє кількісно визначити відносну частку кожного мікроба в певний час та за певних умов. 36,37
В основному використовуються два підходи (рисунок 3). Перший, більш цілеспрямований та широко використовуваний підхід заснований на ПЛР-ампліфікації повної або часткової послідовності 16S рибосомної РНК (16S рРНК) зразка (рис. 3А). 37–39 Другий підхід заснований на виділенні загальної ДНК із зразка, безпосередньо з подальшим її секвенуванням (Малюнок 3B). Цей прямий підхід дозволяє виділити вміст генів у мікробній популяції і таким чином визначити їх здатність. Цей підхід вимагає більшої кількості ресурсів для послідовності і, отже, менш чутливий, ніж попередній, для вивчення біорізноманіття. 37,38 Однак, цілком ймовірно, що цей підхід стане методом вибору завдяки великій кількості інформації про генні функції, яку він сам може надати.
Різні етапи та застосування метагеноміки