Матричні металопротеїнази та їх інгібітори в ході експериментального хронічного

1 Матричні металопротеїнази та їх інгібітори в процесі експериментального хронічного панкреатиту.

експериментального

2 Матричні металопротеїнази та їх інгібітори в процесі експериментального хронічного панкреатиту. урна: nbn: de: gbv: 28-дисс

4 1 Вступ та опитування Вступ Вилучення матеріалу Захворювання підшлункової залози Гострий панкреатит Хронічний панкреатит Моделі панкреатиту тварини Моделі гострого панкреатиту Церулейновий панкреатит Дієта з низьким вмістом холіну Трипсинова модель Оперативна обструкція дванадцятипалої кишки Моделі хронічного панкреатиту Оперативна обструкція дванадцятипалої кишки олеїнової кислоти від трансформації фактора росту - в підшлунковій залозі у надмірної експресії трансгенних мишей трансформації фактора росту - у підшлунковій залозі у трансгенної миші Трансгенна миша з домінантно-негативним мутантом рецептора TGF типу II Підшлункова залоза, індукована тринітробензолсульфоновою кислотою (TNBS) Хронічний експериментальний панкреатит, індукований Дибутилтин дихлорид Зірчасті клітини підшлункової залози Матричні металопротеїнази та тканини Інгібітори матриксних металопротеїназ Фіброз, клітини підшлункової залози та матричні металопротеїнази 16 2 Матеріал та методи Матеріал Хімічні речовини ДНК Олігонуклеотиди Буфери та розчини Бактеріальні культури Набори середовищ Лабораторні тварини Витратні матеріали Індукція хронічного панкреатиту DBTC 21 1

5 2.3 Вилучення РНК із підшлункової залози Виявлення фрагмента контролю експресії мрна Плазмідна ампліфікація ДНК бактерій Кількісна оцінка нуклеїнових кислот РНК-електрофорез Зворотна транскриптаза Конкурентна полімераза Ланцюгова реакція Електрофорез продуктів ПЛР та флуоресценція Підготовка клітин панкреатичної зіркової клітини ПЛР клітин панкреатичної зонти та укладання гелю Виконання електрофорезу та оцінка фарбування гематоксиліном та еозином 32 3 Результати Гістологія панкреатиту DBTC Корекція кДНК за допомогою експресії -актину матриксних металопротеїназ у тканинній експресії MMP експресії MMP-2 та MMP експресії тканинного інгібітора матриксних металопротеїназ у тканині Експресія TIMP Експресія TIMP MMP у зірчастих клітинах підшлункової залози Статистика 41 4 Обговорення Перебіг DBTC панкреатиту MMP MMP-9 з лейкоцитів Взаємозв'язок між базальною мембраною та синтезом MMP MMP-9 у експресії РНК PSC про MMP-9 при хронічному DBTC панкреатиті Експресія РНК MMP-2, MMP-3, TIMP-1 та TIMP-2 при хронічному DBTC висновки Висновки 47 2

6 5 Тези 48 6 Список скорочень 51 7 Література 52 8 Подяка 66 9 Декларація про незалежність 67 3

16 Рисунок 1: Функції клітин під впливом протеолітично активних ММР. (A) Деградація ECM та міграція клітин. (B) індукція проліферації або апоптозу. (C) Модуляція медіаторів та їх рецепторів. (D) Активація подальших протеаз шляхом розщеплення їх проферментів або їх інгібітора (Vu and Werb, 2000). 3 Матричні металопротеїнази - це група з понад 20 відомих цинк-залежних протеаз. Вони здатні розщеплювати основні компоненти позаклітинного матриксу, такі як колаген, ламінін, фібронектин або еластин. Завдяки своїй структурі з різних доменів, ММР можна розділити на чотири групи: матрилізин, ММР з гемопексиноподібними доменами, ММП з трансмембранними доменами, ММП з фібронектиноподібними доменами. Всі ММП мають область, необхідну для секреції, знаходяться в прихованому стані і мають каталітичну область, яка містить активний сайт зв'язування цинку. 53 Однак класифікація MMP проводиться шляхом розподілу їх на сімейства, що узагальнюють субстрати MMP (табл. 1)

18 Це також стосується проферментів. Перекриття конкретності пояснюється 50% гомологією послідовностей TIMP-1 та TIMP-2. 58,61 Отримана активність MMP залежить від співвідношення MMP і TIMP у тканині. Зміни в цій рівновазі призводять або до суттєво підвищеної активності протеолізу ММР 59, або до посилення фіброгенезу. 60 Назва TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 Функція інгібує Pro-MMP-9 та інші активні MMP Інгібує Pro-MMP-2 та активний MMP-2 Не визначено Не визначено Таблиця 2: Інгібітори тканин матричних металопротеїназ ( TIMPs) та їх функції Рисунок 2: Каскад активації матриксних металопротеїназ катепсином та плазміном. Автоактивація Pro MMP активними MMP і MT MMP 1. Пригнічення деградації матриці TIMP. (Evans et al. 1999) 61 15

22 TIMP 2 довжина амплікону: 453 bp TIMP 2 антисмисловий CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA довжина: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA довжина 23 bp вектори pqr2 і pqr3 від Graham M.A. Wells, Neures Limited, Великобританія Буфери та розчини Розчин Comassie Blue Розчин DBTC DEPC- H 2 O 1 частина крижаної оцтової кислоти (50 мл) 3 частини ізопропанолу (150 мл) 6 частин H2O (300 мл) Додати 0,25 г Comassie Blue до 100 мл (1,25 г) . Розчиніть DBTC у 96% етанолі у двох частинах. Потім змішайте з трьома частинами гліцерину. Інкубуйте 1 L dh 2 O з 1% DEPC протягом ночі. Потім вимкніть DEPC автоклавуванням. Еозин 2,5 г Еозин (Індекс кольору) 500 мл H 2 O HBSS + FCS Mayers Гематоксилін PBS (фосфатний буферний розчин) поліакриламідний буфер для електрофорезу 50 мл HBSS і 15 мл FCS 4%, розмістити на льоду. У 750 мл води розчиняють: 50 г сульфату алюмінію (KAl (SO 4) 2 12H 2 O) 1 г гематоксиліну (кольоровий індекс №) 0,1 г йодиту натрію (NaIO 3) 1,0 г лимонної кислоти 50 г хлорогідрату Ad H 2 O до 1000 мл 120 мМ NaCl 170 мм NaH 2 PO 4 3 мм KCl 26 мм KH 2 PO 4, ph 7,2 3,03 г (0,025 М) Трис 14,1 г (0,152 М) гліцину 1,0 г (0,1%) SDS до 1000 мл, заповнених H 2 O. Буфер P1, Qiagen 50мМ Трис ph mM EDTA Рназа A (400мкг/мл) Буфер P2, Qiagen 200мМ NaOH 1% SDS-буфер P3, Qiagen 2,55M KAc ph 4,8 Буфер QBT, Qiagen 750мМ NaCl 50мМ MOPS 15% етанолу ph

23 буфер QC, Qiagen Buffer QF, Qiagen Stop Solution Буфер підкладки TAE буфер 1L 1M NaCl 50мМ MOPS 15% етанол PhM NaCl 50мМ MOPS 15% етанол ph mg апельсин G 2,5g Ficoll 400 EDTA 0,5M 50ммоль/л Tris ph8 + 5 ммоль/л CaCl2 242 г Трис 57 мл оцтової кислоти 96% 100 мл ЕДТА 0,5 М ph8 до 1000 мл H 2 O подвійний розд. Трис-буфер Tris-HCl 1 М у DEPC-H 2 O, рН 7,4 Розчин тритону 2,5% 10 мл Тритон + 490 мл H 2 O Бактеріальні культуральні середовища Штам Escherichia coli DH5 від Gibco BRL (Еггенштейн, Німеччина) використовували як штам бактерій. Поживні середовища для росту бактерій були отримані від лабораторії Difco, Детройт, США. Ампіцилінові агаринові пластинки LB Додайте 100 мг/л ампіциліну до агарних пластинок LB. LB агарові пластини Luria Bertani (LB) - середній 5г екстракт дріжджів 10г триптичного пептону 10г NaCl аква дест. 15 г агару H 2 O переробити до 1 л 5 г дріжджового екстракту 10 г триптичного пептону 10 г NaCl аква дест. Налаштуйте pH до 7,4 H 2 O, переробіть. За допомогою 1 N NaOH. до 1 л буфера трансформації 10% (мас./об.) поліетиленгліколю мМ MgCl 2 у наборах LB-Medium Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Німеччина Qiagen, Hilden, Німеччина Qiagen, Hilden, Німеччина Qiagen, Hilden 20-го