Модель миші, обробленої цефоперазоном, клінічно значущого штаму Clostridium difficile R20291
Резюме
Цей протокол описує модель миші Cefoperazone щодо інфекції Clostridium difficile (CDI) з використанням клінічно значущого та генетично виліковуваного штаму, R20291. Акцент на клінічному нагляді за хворобою C., важким переліком бактерій, цитотоксичністю токсинів та гістопатологічними змінами протягом CDI в моделі миші детально описані в протоколі.
Вступ
Clostridium difficile є анаеробною грампозитивною спороутворюючою паличкою, що викликає небезпечну для життя діарею 1. Інфекція C. difficile (CDI) пов’язана зі збільшенням захворюваності та смертності людей і приносить більше 4,8 млрд. Доларів на охорону здоров’я витрати на рік. У 2013 році Центри з контролю та профілактики захворювань класифікували C. difficile як невідкладний ризик стійкості до антибіотиків, вказуючи на те, що він представляє невідкладну загрозу для здоров’я населення 1. В даний час лікування антибіотиками ванкоміцин та метронідазол вважаються стандартом лікування CDI 5. На жаль, частота рецидивів CDI після успішного лікування антибіотиками є високою, що спостерігається у 20 - 30% пацієнтів 2,5-7. Отже, відкриття нових терапевтичних засобів проти цього кишкового збудника є необхідним. Для оцінки терапевтичних препаратів проти C. difficile необхідна модель тварини, яка наближається до лінійно релевантного штаму захворювання на АС людини.
По-перше, постулати Коха щодо C. difficile були встановлені в 1977 р. З використанням обробленої кліндаміцином моделі сирійського хом'яка 8. Ця модель використовується і сьогодні для вивчення впливу токсинів C. difficile на патогенез. 9.10. Однак CDI в моделі хом'яка призводить до високих показників смертності і не наближає хронічні підступні прояви хвороби, які можна спостерігати у людей із CDI 10,11. Виходячи з доступності та доступності адаптивних платформ миші, пошук моделі миші CDI є актуальним.
У 2008 році була створена надійна модель CDI для мишей, обробляючи мишей коктейлем з антибіотиків у питній воді (канаміцин, гентаміцин, колістин, метронідазол та ванкоміцин) протягом 3 днів, після чого інтраперитонеально вводили кліндаміцин 12. Ця миша зробила сприйнятливий до CDI та важкого коліту. Залежно від дози введеного інокуляту, за допомогою цієї моделі можна спостерігати ряд клінічних ознак та летальність. З цього часу вивчаються різні антибіотичні методи лікування, які модифікують мікробіоти кишечника миші, знижуючи стійкість до колонізації до такої міри, що C. difficile може колонізувати шлунково-кишковий тракт (розглянуто в Best et al. Та Lawley & Young) 13.14.
Зовсім недавно, цефалоспорин широкого спектру дії, цефоперазон, що вводиться у питну воду протягом 5 або 10 днів, робить мишей сприйнятливими до CDI відтворюваними 15. Оскільки введення цефалоспоринів третього покоління пов’язане з підвищеним ризиком розвитку ІХС у людей, використання цефоперазону модель ближче відображає природне захворювання 16. Мишей, сприйнятих до цефоперазону, сприйнятливих до C. difficile, викликали як спори C. difficile, так і вегетативні клітини різних клінічних штамів, що варіюють за значимістю та вірулентністю 17. Незважаючи на деякі оригінальні дослідження з використанням вегетативних клітин C. difficile. Інфекційні, спори C. difficile є вважається основним способом передачі 18.
В останнє десятиліття з’явився C. difficile R20291, штам NAP1/BI/027, який спричинив спалахи CDI 19,20. Ми прагнули визначити клінічний перебіг захворювання, коли мишей, які отримували цефоперазон, піддавали дії клінічно значущого та генетично виліковуваного штаму C. difficile, R20291. Цей протокол деталізує клінічний перебіг, включаючи втрату ваги, колонізацію бактеріями, цитотоксичність токсину та гістопатологічні зміни в шлунково-кишковому тракті мишей, інфікованих спорами C. difficile R20291. Загалом, ця модель миші виявляється цінною експериментальною платформою для CDI, що наближається до захворювань людини. Отже, ця характеристична модель миші може бути використана для оцінки впливу нових терапевтичних засобів на поліпшення клінічного захворювання та на відновлення стійкості до колонізації проти C. difficile.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Етичне твердження:
Інституційна комісія з догляду та використання тварин (IACUC) при Коледжі ветеринарної медицини університету штату Північна Кароліна (NCSU) схвалила це дослідження. Політика NCSU по догляду та використанню тварин забезпечує виконання стандартів та рекомендацій, викладених у Законі про розширення лабораторних досліджень щодо добробуту тварин та охорони здоров’я 1985 р. Заклади для домашніх тварин при NCSU дотримуються вказівок, викладених у Посібнику з догляду та використання лабораторних тварин. Умови здоров’я Тварин оцінювали щодня, а загиблих тварин гуманно евтаназували задушенням СО2 з подальшими вторинними заходами. під час цього дослідження кваліфіковані техніки тварин або ветеринар проводили розведення в акредитованому закладі AAALAC.
1. Введення антибіотика цефоперазону в питну воду для досягнення сприйнятливості до C. difficile Колонізація та хвороби
ПРИМІТКИ:/6 мишей WT віком від 5 до 8 тижнів C57BL (самки та самці) були придбані та поставлені на карантин протягом 1 тижня до початку введення води з антибіотиками. Після карантину мишей влаштовували в автоклаві їжею, підстилкою та водою. Заміни клітини проводили щотижня працівники лабораторії в витяжці з ламінарним потоком.
- Приготуйте цефоперазон (0,5 мг/мл) у стерильній дистильованій воді за 7 днів до цільового дня зараження (Фігура 1).
- Наповніть автоклавовані пляшки з водою цефоперазоновою водою (0,5 мг/мл) і помістіть їх у кожну клітку миші.
ПРИМІТКА: Свіжоприготовлену воду з цефоперазону слід готувати та міняти кожні 2 дні протягом 5 днів, як зазначено в кроках 1.1 та 1.2. Рекомендується відповідне утилізація води з цефоперазоном відповідно до інституційних правил охорони навколишнього середовища та безпеки. - Через 5 днів на воді цефоперазону замініть пляшки на автоклавовані пляшки з водою, наповнені стерильною дистильованою водою. Дайте миші та питну воду на час експерименту.
2. Приготування інокуляту спор C. difficile та зловживання мишами
ПРИМІТКА: Перед початком роботи переконайтеся, що в анаеробну камеру протягом щонайменше 24 годин розміщують: 1x сольовий розчин, забуференний фосфатом (PBS; див. Матеріали), тарілки циклосерину таурохолату цефокситину і фруктози (TCCFA) (див. Матеріали та додатковий файл), та стерильний Г-подібний ретрактор.
ПРИМІТКА: Мишей, інфікованих спорами C. difficile, слід розміщувати у приміщенні для домашніх тварин рівня 2 біобезпеки.
3. Моніторинг втрати ваги мишей та клінічних ознак захворювання протягом всієї інфекції C. difficile
4. Перерахування бактерій вмісту фекалій та вмісту сліпої кишки у C. difficile
ПРИМІТКА: Перш ніж почати, переконайтеся, що такі елементи розміщені в анаеробній камері принаймні на 24 години: 1x PBS (див. Матеріали), пластини TCCFA (див. Матеріали), L-подібний стерильний ретрактор та мікропробірки стерильні та/або ПЛР-планшети для розведень.
5. Аналіз цитотоксичності вероклітин для кількісного визначення цитоксиксилу C. difficile токсину
ПРИМІТКА: Рекомендується проводити цей аналіз після завершення моделі миші на зразках, відібраних під час розтину та зберіганих при -80 ° C. Методи асептичної культури клітин є важливими для запобігання забрудненню клітин Vero. Для виконання цього протоколу потрібно 2 дні. Усі екскременти та вміст кишечника, що використовуються в цьому дослідженні, слід зберігати у стерильно зваженій пробірці для центрифуги (з позначкою "вага пробірки", див. Розділ вище). Кінцева маса пробірки (включаючи вміст) вимірюється за аналітичною шкалою до чотирьох знаків після коми. (див. розділ вище). Для цього тесту рекомендується використовувати багатоканальну піпетку.
ПРИМІТКА. Перш ніж почати, переконайтеся, що доступні наступні: клітини Vero, модифікація Дульбекко середовища Орла (DMEM) 1x з 10% фетальної бичачої інактивованої сироватки (FBS) та 1% середовища пеніциліну/стрептоміцину (позначена як "1x DMEM середовище; "див. матеріали та додатковий файл), 0,25% трипсину-ЕДТА, 1х PBS, 0,4% трипанового синього, культура клітин 96-лункова пласка з рівним дном, одна платівка, 96-лунковий фільтр, Clostridium difficile Toxin A (3 мкл аліквоти на 1 мкг/мкл в ультрачистій воді та зберігати при -80 ° C), антитоксин Clostridium difficile, робочий аркуш (для розрахунків та таблиці карт; див. додаткові файли).
ПРИМІТКА: Під час цього тесту слід бути обережним щодо впливу персоналу на C. difficile та його токсин.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
У репрезентативному дослідженні 5-тижневих мишей C57BL/6 WT попередньо обробляли цефоперазоном у своїй питній воді (0,5 мг/мл) протягом 5 днів і дозволяли щодня 2 вмиватися водою. Регулярне пиття. Миші були атаковані спорами 5-10 C. difficile R20291 пероральним втручанням на 0-й день (малюнок 1А). Мишей спостерігали за втратою ваги та клінічними ознаками (млявість, неадекватність, діарея та згорблена поза) ІРС протягом 14 днів. Виклик мишей C57BL/6 WT зі спорами C. difficile R20291 призвів до діареї протягом 24 годин та значної втрати ваги протягом 48 годин після зараження (малюнок 1B). Хоча цього не спостерігали в цьому експерименті, миші, яким було застосовано більшу дозу C. difficile R20291, можуть стати важкими хворими або втратити вагу понад 20% протягом 48-72 годин після зараження, що вимагає евтаназії. Отже, мишам потрібно мінімум два рази на день спостереження після зараження спорами C. difficile.
У цьому репрезентативному дослідженні значна кількість втрати ваги та клінічних ознак захворювання у мишей також спостерігалася на 2-7-й день після зараження. (малюнок 1B). Через 7 днів після зараження миші почали набирати вагу, і клінічні ознаки захворювання вщухли. Останній тиждень експерименту миші виявились клінічно нормальними, без ознак клінічних ознак ІХС, включаючи діарею.
Фекальні гранули збирали перед зараженням спорами C. difficile і кожні 48 год після зараження. (малюнок 1С). До лікування антибіотиками мишей не колонізували C. difficile. Через 24 години зараження спорами C. difficile мишей колонізували 10 7 КУО C. difficile на г фекалій. (Малюнок 1С). Миші залишалися послідовно колонізованими C. difficile протягом усього експерименту, незважаючи на відсутність доказів втрати ваги або клінічних ознак CDI протягом останніх 7 днів експерименту.
Чотири миші (2 самці та 2 самки) були гуманно евтаназовані та підготовлені до розтину на 0 день до зараження, щоб служити неінфікованими контролями. Крім того, по одній миші з кожної клітини було гуманно евтаназовано та підготовлено до розтину на 2, 4, 7 та 14 дні після зараження. (малюнок 1А). Підрахунок C. difficile у вмісті сліпої кишки проводили при кожному розтині. Згідно з переліком калу, у сліпій кишці мишей не виявлено C. difficile до зараження C. difficile. Через 48 годин після зараження мишей колонізували приблизно 10 8 КУО C. difficile на г вмісту сліпої кишки. (Малюнок2А). Усі миші залишалися постійно колонізованими протягом усього експерименту.
Вміст сліпої кишки також оцінювали на інфекцію на наявність токсину C. difficile за допомогою аналізу цитотоксичності клітин Vero. Жодних доказів цитотоксичності токсину C. difficile не виявлено в калі до виклику (малюнок 2B). Цитотоксичність C. difficile була виявлена через 2 дні після зараження спорами C. difficile і зберігалася протягом усієї інфекції. Незважаючи на досить рівномірну колонізацію C. difficile, у окремих мишей спостерігаються зміни рівня цитотоксичної активності C. difficile. (малюнок 2B).
Рекомендується проводити гістологічну оцінку сліпим ветеринарним патологоанатомом. Для оцінки тканин слід застосовувати бальну систему 0-4 для окремої оцінки набряків, запальної інфільтрації клітин та пошкодження епітеліальних клітин в клубовій кишці, сліпій кишці та товстій кишці на основі системи.
Після сліпого гістопатологічного дослідження мишачої клубової кишки, сліпої кишки та товстої кишки за допомогою C. difficile R20291, найважливіші патологічні зміни були відзначені в сліпій кишці (Малюнок 3). Загальний показник гістологічної оцінки сліпої кишки суттєво відрізнявся між днем 0 та днем 2 та днем 4 після обстеження. Значних уражень в клубовій кишці протягом усієї інфекції не спостерігалося. (Малюнок 3). У товстій кишці відзначено помірне ураження. Загальні гістологічні показники товстої кишки суттєво відрізнялись між днем 0 та днем 2 та після завдання 7 (рисунок 3).
Розділи, що представляють H&E клубової кишки, сліпої кишки та товстої кишки через зараження, доступні за адресою малюнок 4. Кожне зображення має відповідну загальну гістологічну оцінку та індивідуальні оцінки пошкодження епітелію, запалення та набряку, як визначено сертифікованим сліпим ветеринарним патологом (SAM).
Малюнок 3: гістологічне позначення мишачої клубової кишки, сліпої кишки та товстої кишки протягом з зараження C. difficile R20291. Загальний гістологічний бал обчислювали шляхом підсумовування трьох балів оцінюваних параметрів: пошкодження епітелію, запалення та набряк. Жодних істотних гістопатологічних змін в клубовій кишці не зафіксовано. Тканина сліпої кишки містила найбільш значущі гістологічні ураження під час CDI. Загальні показники гістологічного дослідження сліпої кишки суттєво відрізнялись від 0-го дня до 2-го та 4-го днів після зараження. У товстій кишці відзначено помірне ураження. Загальні гістологічні показники товстої кишки суттєво відрізнялися від днів 0 та 2-го дня після обстеження. Значимість визначали за допомогою односпрямованого непараметричного тесту ANOVA Крускала-Уолліса з подальшим посттестом Данна (*, p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; ***, p804; 0,001; * ***, P ≤ 0,0001). Смужки помилок представляють стандартні відхилення середнього значення. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 4: Гістопатологія протягом зараження C. difficile R20291. Ця панель містить репрезентативні ділянки H&E клубової кишки, сліпої кишки та товстої кишки через інфекцію C. difficile R20291. Загальні гістологічні показники наведені в дужках () для відповідного дня та перерахованих тканин: для 0-го відділу клубової кишки 0-го, 2-го (1), 4-го (0), 7-го (0) та 14-го (0) днів; для сліпої кишки день 0 (0), день 2 (5), 4 дні (4), 7 днів (3) та 14 днів (3); а для товстої кишки день 0 (0), день 2 (4), 4 дні (1), 7 днів (4) та 14 днів (2). Мікрофотографії були отримані на Світловому мікроскопі з 5-мегапіксельною цифровою камерою та супровідним програмним забезпеченням (шкала відповідає 200 мкм). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.