Модель самообмеженої гострої травми легенів одностороннім протоколом внутрішньо-бронхіальної інстиляції

Резюме

Вибіркове закапування внутрішньо-бронхіальної кислоти в ліву легеню у мишей призводить до одноразового та самообмеженого гострого пошкодження легенів, що моделює гострий респіраторний дистрес-синдром (ARDS), спричинений аспірацією шлункової кислоти.

Анотація

Селективне внутрішньо-бронхіальне закапування соляної кислоти (HCl) у ліві бронхи головного стовбура миші спричиняє гостре пошкодження тканин із гістопатологічними даними, подібними до синдрому гострого респіраторного дистрессу у людини (ARDS). Виниклий набряк альвеол, пошкодження альвеолярно-капілярного бар’єру та інфільтрація лейкоцитів в основному вражають ліву легеню, зберігаючи праву легеню як неушкоджену контрольну систему і дозволяючи тваринам вижити. Ця модель гострого самообмеженого пошкодження легенів дозволяє досліджувати механізми роздільної здатності тканин, такі як ефероцитоз макрофагів з апоптотичних нейтрофілів та відновлення цілісності альвеолярно-капілярного бар'єру. Ця модель визначила важливу роль агоністів роздільної здатності, включаючи спеціалізовані медіатори розв’язування (ПМС), забезпечуючи основу для розробки нових терапевтичних підходів для пацієнтів з РПС.

Вступ

Порушення регуляції вродженої імунної відповіді під час ексудативної фази сприяє гострому початку ГРДС та пов'язаної з цим дихальної недостатності 1. Потужний прозапальний медіатор, який передає сигнали, організовує початкові імунні реакції, що призводить до порушення альвеолярно-капілярного бар’єру, дифузного набряку альвеол та нейтрофільної інфільтрації в місці пошкодження легеневої тканини 4. У ARDS неефективні гальмівні сигнали для гострого запалення схильні до легеневої недостатності. і може затримати своєчасний катабаз пошкодженої легеневої тканини.5 З цією метою доклінічне дослідження ендогенних механізмів ініціації та вирішення про ARDS може розкрити нові терапевтичні стратегії. Таке дослідження вимагає самообмежених експериментальних моделей гострого пошкодження легенів in vivo, які дуже нагадують особливості ARDS людини, що дозволяє проводити опитування механізмів, що лежать в основі ініціації та вирішення фаз пошкодження тканин.

Представлена ​​тут мишача модель дає прямі гострі легеневі ураження, які демонструють кардинальні патобіологічні процеси ексудативного ГРДС, а саме порушення альвеолярно-капілярного бар’єру та нейтрофільну інфільтрацію. Метод спирається на селективне внутрішньо-бронхіальне закапування HCl шляхом канюляції лівого головного стовбура бронха, локалізуючи травму та запальну реакцію на ліву легеню; неушкоджену праву легеню можна використовувати як внутрішній контроль для певних визначень пошкодження тканин та запалення. Крім того, одностороннє пошкодження легенів не є смертельним і демонструє програму вирішення. Це забезпечує чітке вікно у вирішенні запалення легенів, яке можна використати для виявлення ендогенних клітинних медіаторів та механізмів, що розсмоктують, та відкриття нових терапевтичних шляхів для ARDS, що робить акцент на вирішенні питань фізіології та фармакології.

Протокол

Усі процедури, пов’язані з тваринами, переглянуті та схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Бригама та Жіночої лікарні (Протокол № 2016N000356).

ПРИМІТКА: Для всіх процедур виживання дотримувались стерильної техніки. Для кожної операції встановлювали стерильну драпіровку за допомогою стерильного драпірованого рушника, тоді як хірурги носили стерильні хірургічні рукавички, шапки, маски та чисті лабораторні халати. Всі хірургічні інструменти стерилізували за допомогою автоклава, а стерильність підтримували за допомогою стерилізатора для бісеру.

1. Приготування 0,1 N HCl

2. Селективне внутрішньо-бронхіальне закапування HCl

3. Післяопераційний догляд

  1. Після того, як розріз закритий, наведіть на нього мишу ліва сторона на теплій нагрівальній подушці, поки миша не вийде з наркозу. Почніть контролювати мишу на предмет болю та рівня активності, перш ніж повернути її до нормального житла.
    ПРИМІТКА: Бупренорфін слід вводити по 0,1 мг/кг підшкірно кожні 6-12 годин протягом перших 24 годин. Якщо присутній постійний проривний біль, продовжуйте режим знеболення, поки біль не вщухне.

4. Бронхоальвеолярний лаваж цілого легені (BAL) та імунофенотипування лейкоцитів

5. Оцінка проникності повітряного бар'єру за допомогою синього барвника Евана (DME)

  1. Введіть синій барвник Евана (40 мг/кг) внутрішньовенно за 30 хв до евтаназії.
  2. Евтаназію миші, використовуючи передозування кетаміном/ксилазином (крок 4.1).
  3. Щоб виміряти цілісність альвеолярного бар'єру, виконайте кроки 4.2-4.9 для збору BAL.
  4. Перенесіть 100 мкл BALF на 96-лункову мікропланшет внизу разом із 100 мкл повторюваних стандартів EBD. Використовуйте PBS -/- як заготовку.
  5. Використовуйте зчитувач мікропланшетів для вимірювання поглинання BALF при 620 нм та 740 нм. Використовуйте поглинання при 740 нм, щоб виправити забруднення гему у зразках 7 .
  6. Для вимірювання цілісності судинного бар'єру перфузуйте легені, повільно вводячи 5 мл крижаного PBS -/- через правий шлуночок серця. Видалити ліву легеню.
  7. Сушіть ліву легеню протягом 72 год при 58 oC, щоб видалити надлишок води.
  8. Обробляйте висушену легеневу тканину, як у Radu та Chernoff 2013 8, та вимірюйте поглинання при 620 нм та 740 нм.

6. Гістологія легенів

  1. Канюлюйте трахею, виконавши кроки 4.1-4.5.
  2. Щоб встановити тиск у легенях на 20 см H2O, використовуйте тримач та кільцеві щипці, щоб підняти шприц об'ємом 60 мл, обладнаний трубкою клапана та наповнений вибраним фіксуючим розчином (наприклад, цинковим фіксатором) так, щоб меніск фіксуючого розчину становив 20 см. вище фіксуючого розчину. Легені.
  3. Приєднайте трубку до катетера і відкрийте значення. Повільно наповнюйте легені лаком для волосся, поки вони не перестануть набрякати.
  4. Витягніть катетер на 3/4 виходу з трахеї. Закріпіть трахею швом перед повним видаленням катетера, щоб мінімізувати втрату фіксатора.
  5. Видаліть легені та серце en bloc.
    ПРИМІТКА: Переконайтесь, що легені не проколюються під час видалення, щоб утримувати фіксуючий тиск.
  6. Зафіксуйте легені на 24 год у 25 мл фіксатора при кімнатній температурі.
  7. Промивати фіксовані легені протягом послідовних інтервалів по 20 хв у PBS -/-, 30% етанолі та 50% етанолі.
  8. Після останнього промивання зберігайте легені в 70% етанолі для лікування гістології, як у Eickmeier et al. 2013 рік 9 .

Репрезентативні результати

Вибіркове закапування внутрішньо-бронхіальної HCl призводить до одностороннього гострого ураження легенів

Гостра одностороння травма легенів дозволяє дослідити механізми розв’язання

самообмеженої
Рисунок 1: Вибіркове закапування внутрішньо-бронхіального HCl призводить до одностороннього ураження легенів, що визначається порушенням альвеолярного бар’єру та інфільтрацією нейтрофілів. (AT) Ілюстрація канюляції головного стовбура миші лівого бронха для вибіркового закапування HCl у ліву легеню. () Видалено з правого (RL) та лівого (LL) легенів, підданих селективному закапуванню кислоти та перфузованих після внутрішньовенного введення синього барвника Evan. (VS) Кількісне визначення інтервального блакитного барвника Евана з гомогенізованої та перфузійної легені через 24 год після травми кислотою або помилкового контролю; фігура адаптована за Абдульнуром та ін. 2014 6. Значення представляють середнє значення SEM, де n 5. -p lt; 0,05, U-тест Манна-Уітні. (D) Репрезентативна проточна цитометрія внутрішньосудинних (IV; флуорофор 1) та інтерстиціальних (I.S .; флуорофор 2) нейтрофілів як відсоток від загальної кількості CD45 - клітин у легенях, оброблених через 24 години після пошкодження кислотою. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Рисунок 2: Важка одностороння травма легенів є самоізолюючими. (AT) Репрезентативна гістологія H та E (10x) лівих легенів, отриманих від наївних мишей (0 год.) Або від мишей через 24, 48, 72 год. Після пошкодження, а також асоційованої правої легені тієї ж миші (бар d ' 250 м). () Цитометрія, репрезентативна для потоку альвеолярних нейтрофілів (Ly6G та CD11b), отриманих із цілого легеневого лаважу, у відсотках від загальної кількості CD45 - клітин у мишей або наївних мишей (0 год) через 24, 48 та 72 год після ураження кислотою. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Обговорення

Описаний тут метод внутрішньо-бронхіальної інстиляції використовує селективне скасування головного стовбура лівого бронха для закапування HCl в ліву легеню, що призводить до гострого уніального та самообмеженого пошкодження мишей у мишей. Ця модель пошкодження легенів мишачої кислоти тісно представляє запальну реакцію, гістопатологію та фізіологічну дисфункцію, що спостерігається при ARDS людини, де аспірація шлункової кислоти є загальним фактором, що викликає або сприяє. Вплив дихальних шляхів миші на низький pH hCl призводить до збільшення проникності альвеолярно-капілярний бар’єр, альвеолярний емез та глибока нейтрофільна інфільтрація в місці пошкодження. Ці події не спостерігаються в неушкодженій правій легені. Крім того, ця модель виробляє швидкі запальні реакції, які досягають максимуму протягом 24 годин після інстиляції кислоти, і поділяє зміни в експресії генів із ARDS людини, такі як диференційна експресія ізоформ фосфоліпази D 10.

Хоча ця мишача доклінічна модель відтворює багато особливостей ARDS на молекулярному, клітинному та тканинному рівнях, вона не повністю рекапітулює ARDS людини. Визначення ARDS включає двостороннє ураження легень 3, тоді як описаний тут метод закапування призводить до зачаття при односторонньому захворюванні легенів. Крім того, тваринам не потрібна постійна механічна вентиляція, нерухомість або парентеральна седація. Результати, представлені тут (void supra) та в інших місцях 6, 9, 11, 12, 13, демонструють, що одностороннє ураження легенів, спричинене кислотою, імітує більшість патологічних особливостей ГРДС, забезпечуючи при цьому унікальну можливість використовувати правильну легеню як внутрішню контролювати та вивчати фазу вирішення цієї хвороби. Таким чином, розглянута тут модель моделює ардобіологію ARDS, але також дозволяє механістично вивчати основні реакції легеневої тканини на пошкодження та механізми розрішення, які можуть бути релевантними для лікування цього важливого захворювання.

Під час розробки методу у дорослих мишей у віці 8-12 тижнів 2,5 мл/кг внутрішньо-бронхіальної HCl викликав значні, але сублетальні гострі пошкодження; менші дози HCl не призвели до відтворюваних та однорідних пошкоджень легенів. Незважаючи на те, що ми не застосовували цю модель у молодших (наприклад, 3-6 тижнів) або старших (наприклад, 10-14 місяців) мишей, ми передбачаємо, що вагова доза HCl спричинить фенотип легеневого ураження, подібний до того, що спостерігався у мишей Віком від 8 до 12 тижнів. Ми рекомендуємо дослідникам титрувати дози HCl для досягнення бажаного ступеня ураження легенів перед проведенням експериментів з мишами на кінці ваги.

Для найкращого вивчення просторово-часового регулювання механізмів роздільної здатності необхідні експериментальні моделі in vivo. Гострі моделі ураження легенів повинні включати відповідні гострі запальні реакції та дисфункцію органів поряд із залученням дозволу господаря, що сприяє молекулярним та клітинним процесам. Кількісно оцінити ці механізми можна за допомогою встановлених індексів роздільної здатності 22. Вибірковий метод внутрішньо-бронхіальної інстиляції для генерування гострого одностороннього пошкодження легенів виявився корисним у цьому відношенні для медіаторів та ендогенних шляхів роздільного зондування. У майбутніх дослідженнях, які поглиблюють наше розуміння цих активних процесів розв’язання, передбачається привести до терапевтичних агоністів, що імітують біореакції ендогенних ліпідних медіаторів, щоб збільшити роздільну здатність запалення та полегшити захворюваність та смертність від SVers та інших важливих захворювань легенів.