Наростання клубочків як аналіз Ex Vivo для аналізу шляхів, задіяних в тім’яній епітеліальній клітині

Резюме

У цій статті описаний метод культивування та аналізу виростів клубочкових парієтальних епітеліальних клітин із капсульованих клубочків, виділених із нирки миші. Цей метод може бути використаний для вивчення шляхів, що беруть участь у проліферації та міграції клітин парієтального епітелію.

Анотація

Вступ

Гломерулярні захворювання є важливою групою захворювань нирок і є основною причиною термінальної стадії хвороби нирок (ШОЕ) .На жаль, конкретні можливості лікування обмежені, і перехід на ШОЕ неминучий. Клубочкові захворювання визначаються наявністю пошкоджень клубочків і можуть бути згруповані в запальні та незапальні захворювання. Незважаючи на те, що початкова образа відрізняється, останні дослідження показали, що загальний клітинний механізм призводить до гіперплазії епітеліальних клітин клубочків і, зрештою, до гломерулосклерозу при всіх захворюваннях клубочків, незалежно від основної причини 1, 2, 3, 4 .

Зокрема, було показано, що гломерулосклеротичні ураження в основному складаються з активованих клітин парієтального епітелію 5, 6. У фізіологічних умовах клітини парієтального епітелію - це плоскі, сплячі епітеліальні клітини, які вистилають капсулу Боумена з клубочком. Однак будь-яке пошкодження клубочків через генетичні мутації (наприклад, специфічні для подоцитів або мітохондріальні цитопатії), запалення або гіперфільтрація (наприклад, спричинені зниженням маси нирок, високим кров'яним тиском, ожирінням або цукровим діабетом) може спричинити активацію клітин парієтального епітелію. . Активовані парієтальні клітини епітелію розмножуються і відкладають позаклітинний матрикс, що призводить до утворення клітинних півмісяців або склеротичних уражень 5, 7, 8. Прогресування цих процесів призводить до втрати функції нирок 9. Отже, активація активації парієтальних епітеліальних клітин є ключовим фактором розвитку та прогресування гломерулосклерозу при запальних та незапальних захворюваннях клубочків 1, 2, 3, 4, 10 .

Молекулярні процеси, що опосередковують активацію клітин парієтального епітелію, досі в основному невідомі. Недавні дослідження показують, що активовані клітини парієтального епітелію de novo EXPRESS CD44, рецептор, який бере участь у активації різних шляхів у проліферації та міграції клітин. Крім того, було показано, що інгібування CD44 інгібує активацію активації парієтальних епітеліальних клітин і послаблює прогресію утворення півмісяця та гломерулосклероз на тваринних моделях запальних та незапальних захворювань клубочків 11, 12.

Оскільки активація клітин парієтального епітелію є важливим фактором у розвитку гломерулосклерозу та утворення півмісяця, інгібування цих клітин може уповільнити прогресування хвороб клубочків. З'ясування молекулярних шляхів, що рухають активацією клітин парієтального епітелію, може призвести до розробки специфічних терапевтичних втручань, що послаблюють утворення гіперпластичних та гломерулоклеротичних уражень при захворюваннях клубочків.

На експериментальних моделях на тваринах часто буває важко надати докази прямого впливу зміненої експресії генів (нокаутовані моделі або трансгенні моделі мишей) або медикаментозного лікування на клітини парієтального епітелію. У звичайної нокаутованої миші спостережувані зміни in vivo можна пояснити прямими змінами клітин парієтального епітелію. Однак, оскільки експресія генів також змінюється в інших типах клітин у миші, не можна виключати непрямі ефекти, опосередковані іншими типами клітин. Розвиток умовних мишей Cre-Lox, керованих промоторами, які в основному активні в клітинах парієтального епітелію, в деяких випадках забезпечив рішення для 13 пацієнтів. Однак умовні трансгенні моделі є складними, і хоча стає доступним більше умовних ліній, багато традиційних нокаут-ліній або трансгенних ліній миші все ще не замінюються умовно.

Для вивчення прямого впливу на клітини парієтального епітелію наша група розробила аналіз ex vivo, використовуючи одиничні інкапсульовані клубочки, виділені з нирок миші, для вимірювання та аналізу проліферації та міграції клітин парієтального епітелію. Цей метод дозволить нам визначити специфічні ефекти парієтальних епітеліальних клітин та знайти відповідальні шляхи для активації клітин парієтального епітелію та протестувати варіанти лікування, що пригнічують цю активацію.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Всі експерименти на тваринах проводились згідно з керівництвом Комітету з етики тварин Університету Радбоу Неймеген.

ПРИМІТКА: Нелікованих здорових мишей дикого типу (n = 4) та мишей cd44 -/- (n = 4) забивали у віці від 12 до 16 тижнів. Були використані як миші, так і самки. Всі миші були на тлі C57Bl/6.

1. Пожертвуйте здоровими мишами WT або генетично модифікованими мишами шляхом вивиху шийки матки.
2. Розсікають цілі нирки миші відразу після жертвоприношення мишей. Для цього зробіть серединну лапаротомію ножицями на животі, розріжте шкіру, а потім м’язи живота. Вийміть кишечник і поставте його поруч з мишею.
3. Звільніть нирки від приєднання до тканин і витягніть нирку хірургічними плоскогубцями, ножицями переріжте ниркову артерію, ниркову вену та сечовід.
4. Видаліть ниркові капсули з нирок, утримуючи нирку хірургічними щипцями, і відшаруйте капсулу іншою парою щипців.
5. Підготуйте нирки в 6-лунковій пластині для культури клітин (2 нирки/лунка) з 2 мл збалансованого сольового розчину Фон Хенкса (HBSS) на лунку та помістіть на лід.

2. Виділення клубочків з нирки миші

3. Культивування виросту клубочка

4. Аналіз проліферації парієтальних епітеліальних клітин

5. Характеристика росту клітин клубочків

ПРИМІТКА. Для оцінки клітинного складу виросту проводять імунофлуоресцентне фарбування для клітин-специфічних маркерів на клубочкових виростах при t = 6 днів.

1. Обережно видаліть середовище та обережно промийте клубочки двічі сольовим розчином, забуференним фосфатом (PBS).
2. Зафіксуйте протягом 10 хв при кімнатній температурі 2% (мас./Об.) Параформальдегіду (PFA) з додаванням 4% (мас./Об.) Сахарози в PBS і ретельно промийте 2x PBS.
3. З первинним антитілом з відповідною концентрацією (Таблиця матеріалів) Інкубуйте в PBS-овечому сироватковому альбуміні (BSA), розведеному 1% (об/об) протягом 1 год при кімнатній температурі.
4. Видаліть розчин антитіла і обережно промийте 3x PBS.
5. Інкубуйте з вторинними антитілами (Таблиця матеріалів) розведений у PBS-BSA 1% (об/об) у темряві протягом 45 хв при кімнатній температурі.
6. Обережно промийте 3 рази PBS і зберіть 1-2 краплі водного середовища для складання з 4,6-діамідино-2-феніліндолом (DAPI), щоб візуалізувати ядра і закрити лунку накладкою з круглою кришкою.
7. Робіть мікроскопічні знімки за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Рисунок 1: Схематичний огляд методу для проведення аналізу росту клубочків для аналізу проліферації епітеліальних клітин. (1) Нирки розсікають від принесеної в жертву миші і подрібнюють на дрібні шматочки. (2) Ниркова тканина просочується через сито довжиною 300 м і промивається через сито 75 м і 53 м. (3) Клубочки, що залишаються на ситах, збирають із середнім + 20% (об/об) FCS і переносять на наднизьку монтажну пластину. (4) Окремі клубочки збирають за допомогою перевернутого світлового мікроскопа і переносять на 24-лункові культуральні планшети. (5) Після інкубації при 37 ° С, 5% (об/об) СО2 протягом 6 днів, наріст клубочків можна аналізувати за допомогою цифрового інвертованого світлового мікроскопа. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Рисунок 2: Клубочковий виріст ізольованих інкапсульованих клубочків з нирок, розсічених мишами WT. Зростання інкапсульованих клубочків, інкубованих при 37 ° С, вказується в різний час: (А.) 0 днів, (B.) 2 дні, (C.) 4 дні і (Д.) 6 днів. Декапітульовані клубочки також виділяли і культивували при температурі 37 ° C, і проводили мікроскопічні зображенняДень0 та (Ф.) День 6, який не показав зростаючих клітин. Смуга шкали: (A, E, F) 200 'м, ((B.) 400 'м, ((CD) 1000 'м. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Рисунок 3: Клітини клубочків, що ростуть, демонструють експресію маркера парієтальної епітеліальної клітини. Імунофлюоресцентне фарбування проводили на 6-ту добу після виділення окремих капсульованих клубочків з метою характеристики зарослих клітин епітелію. Переростаючі клітини, позитивно забарвлені на маркери клітин парієтального епітелію: (А.) CD44, (B.) SSeCKS та (C.) claudin-1, але не виявляло вираження (Д.) специфічний для подоцитів маркер синаптоподин або (E.) ендотеліальний клітинний маркер CD31, який знаходився виключно в клубочку. Смуга шкали: (A, B, D, E) 100'м, (C.) 50 'м. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Малюнок 4: Рост клубочків порушений у клубочках, виділених від мишей-нокаутів CD44. Інкапсульовані клубочки отримували з розсічених нирок з (А.) WT миші та (B.) cd44 -/- миші ізольовані. Мікроскопічні зображення були зроблені через 6 днів у культурі за допомогою цифрового інвертованого світлового мікроскопа. Кількість переростаючих клітин парієтального епітелію та площа поверхні виросту були збільшені в клубочках мишей WT порівняно з мишами cd44 -/-, що вказує на важливу роль CD44 в активації клітин парієтального епітелію. Шкала масштабу: 1000 м. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Рисунок 5: Приклад аналізу поверхні наросту клубочка як маркера проліферації пристінкових епітеліальних клітин за допомогою ImageJ (FIJI). (А.) Клубочковий наріст інкапсульованого клубочка WT-миші через 6 днів у культурі при 37 ° C. (B.) Спочатку визначається шкала для аналізу поверхні в мм 2. Тут: 1 мм = 460 пікселів. (C.) Після встановлення шкали проводиться виділення лінії навколо зони вирощення клубочків. (Д.) Цю вибрану область можна виміряти (поверхня в цьому прикладі = 2235 мм 2). Шкала масштабу: 1000 м. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Протокол, описаний у цій статті, може бути використаний для використання окремих капсульованих клубочків для оцінки проліферації клітин парієтального епітелію, що є наслідком активації клітин парієтального епітелію. Ця модель ex vivo дозволить нам детально вивчити молекулярні шляхи, задіяні в активації клітин парієтального епітелію. Описаний метод базується на простій концепції дисекції та просіювання нирок для виділення та культивування інкапсульованих клубочків та порівняння проліферації та/або міграції клітин парієтального епітелію в різних експериментальних умовах. Результатами, які можна проаналізувати через 6 днів у культурі, є, наприклад, площа поверхні або діаметр виросту або кількість переростаючих клітин одного капсульованого клубочка. Іншим додатком для цього тесту може бути вивчення дії препаратів, які індукують або інгібують молекулярні шляхи, які можуть брати участь в активації клітин парієтального епітелію.

Фарбування імунофлюоресценцією підтвердило, що переростаючі клітини є клітинами парієтального епітелію через 6 днів у культурі, оскільки вони були позитивно позначені на маркери клітин парієтального епітелію (CD44, клаудин-1, SSeCKS), але не виражали ні специфічного для подоцитів маркера синаптоподину, ні маркера ендотеліальних клітин. Відповідно до результатів фарбування, через 6 днів після виділення та посіву окремих декапсульованих клубочків не спостерігалося переростання клітин, що свідчить про обмежене забруднення інших клітин клубочків у нарості протягом цього 6-денного періоду. Інше дослідження також аналізувало наріст клубочків і показало, що швидко зростаючі клітини, отримані внаслідок переростання клубочків, насправді були отримані з клітин парієтального епітелію 14.

Протокол фарбування, який використовується для аналізу експресії маркерів переростаючих клітин, також може бути адаптований до інших молекул, що представляють інтерес. Імунофарбування проводили в лунках планшетів, в яких клубочки інкубували протягом 6 днів. Ці лунки не покривали протягом перших 2-3 годин інкубації, але клубочки прикріплювали до лунок. Інкубація на скляних вставках або системі зсуву камери, що призвело б до кращої візуалізації, була неможливою, оскільки клубочки не були повністю прикріплені до поверхні, і зростання клубочків погіршився. Цей специфічний протокол був нещодавно встановлений для вивчення росту парієтальних епітеліальних клітин від клубочків здорових WT та мишей cd44 -/- 11. За допомогою цього методу було показано, що CD44-дефіцидні клітини парієтального епітелію мають знижену швидкість проліферації, що також показано на малюнку 4буде показано. Цей метод також може бути використаний для мишей інших штамів, а також для інших генетично модифікованих мишей. Наприклад, попереднє дослідження використовувало подібний підхід для аналізу ефектів сигналізації глюкокортикоїдних рецепторів 15.

Застосування цієї методики для виділення клубочків від мишей та аналізу клітинних виростів має багато переваг перед використанням увічнених клітинних ліній парієтального епітелію для аналізу шляхів, що беруть участь в активації клітин парієтального епітелію, або препаратів, що перешкоджають процесу Може вплинути на проліферацію епітеліальних клітин. Перш за все, в цьому методі використовуються первинні клітини, які ростуть безпосередньо з клубочка і перебувають у культурі лише 6 днів. Отже, клітини парієтального епітелію із нарістків клубочків зазнали менших змін у фенотипі, ніж вічні клітинні лінії, які вимагають додаткових проходів росту для отримання клітинної лінії 16. Крім того, описаний тут метод може бути використаний для порівняння ефекту специфічних генних нокаутів на проліферацію парієтальних клітин також для шляхів, які важко вимкнути в клітинні лінії через порушення клітинного росту або ефективності генних нокаутів із використанням методів замовчування.

Для адаптації протоколу до інших моделей тварин або тканини нирок людини слід оптимізувати розмір сит для найкращого результату. Це пояснюється тим, що розміри клубочків різняться між видами, і тому розмір сит, на яких можна збирати клубочки, різниться. Також важливо виділити цілі, інкапсульовані клубочки для цілей цього методу. Тому клубочки не слід стискати, а обережно промивати через менші сита.

Ще одним важливим етапом у протоколі є збір капсульованих клубочків після просіювання. Тут важливо використовувати середовище з 20% FCS, щоб уникнути прикріплення клубочків один до одного. Крім того, збагачений клубочками розчин слід переносити безпосередньо на наднизькі адгезивні пластинки, інакше клубочки будуть прикріплені безпосередньо до поверхні звичайних пластинок для культивування клітин і навіть до поверхні пластикових трубок, що ускладнює виявлення та виділення окремих клубочків.

Після збору окремих капсульованих клубочків їх слід культивувати протягом 3 годин у невеликому обсязі живильного середовища в центрі лунки, щоб забезпечити адгезію. Клубочки не повинні плавати у напрямку до бортової лінії свердловин, щоб оптимізувати показники під час аналізу зображення.

Для досягнення найкращих результатів за допомогою описаного тут протоколу ми рекомендуємо культивувати окремі клубочки та проводити зчитування на 6 день. У цей момент часу можна спостерігати однорідний клітинний наріст, що складається з клітин парієтального епітелію. Пізніше наріст клубочків стає фенотипово неоднорідним, що свідчить про ріст інших типів клітин. Тому протокол, здається, не підходить для дуже тривалого часу інкубації. Слід зазначити, що час інкубації виростів клітин парієтального епітелію може різнитися у різних видів або у різних штамів мишей. Тому час культивування слід перевіряти та оптимізувати для кожного штаму миші або виду. Крім того, походження клубочкового виросту завжди слід перевіряти фарбуванням для специфічних маркерів пристінкових епітеліальних клітин.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

---