Неінвазивна візуалізація дисемінованого кандидозу у протоколах личинок даніо (переклад на французьку)

Резюме

Швидкий розвиток, малі розміри та прозорість даніо дають значну користь для вивчення вродженого імунного контролю інфекції 1-4. Тут ми демонструємо методи зараження личинок даніо з використанням грибкового збудника Candida albicans. Шляхом мікроін’єкції, методологія, що нещодавно застосовувалась для залучення активності фагоцитарної НАДФН-оксидази до контролю диморфізму грибів 5 .

Анотація

Дисемінований кандидоз, спричинений збудником Candida albicans, є клінічно важливою проблемою у госпіталізованих осіб і пов’язаний із 30-40% -ю смертністю, що приписується 6. Системний кандидоз, як правило, контролюється вродженим імунітетом, а особи з генетичними відхиленнями у вроджених імунних клітинних компонентах, такі як оскільки фагоцитарні НАДФН-оксидази більш схильні до кандидемії 7-9. Про динаміку взаємодії C. albicans з природженими імунними клітинами in vivo відомо дуже мало. Широкі дослідження in vitro встановили, що поза хазяїном C. albicans проростає всередину макрофагів і швидко руйнується нейтрофілами 10-14. Дослідження in vitro, хоча і корисні, не можуть узагальнити комплекс в середовищі in vivo, що включає з часом динаміку рівня цитокінів, прикріплення позаклітинного матриксу та міжклітинні контакти 10, 15-18. Для того, щоб дослідити внесок цих факторів у взаємодію хазяїн-збудник, важливо знайти модельний організм, який би неінвазивно візуалізував ці аспекти інфекції в інтактному живому господарі.

Личинка даніо забезпечує унікального та універсального господаря хребетних для вивчення інфекції. Протягом перших 30 днів розвитку личинки даніо мають лише вроджений імунний захист 2, 19-21, що спрощує вивчення таких захворювань, як дисемінований кандидоз, які сильно залежать від вродженого імунітету. Невеликі розміри та прозорість личинок даніо дозволяють відобразити динаміку зараження на клітинному рівні як для господаря, так і для збудника. Флуоресцентні трансгенні личинки з вродженими імунними клітинами можуть бути використані для ідентифікації конкретних типів клітин, які беруть участь в інфекції 22-24. Модифіковані антисмислові олігонуклеотиди (морфолінози) можна використовувати для збиття різних імунних компонентів, таких як фагоцитарна НАДФН-оксидаза, та для вивчення змін у відповідь на грибкову інфекцію в 5 літрах. На додаток до етичних та практичних переваг використання невеликого нижнього хребетного, личинки даніо дають унікальну можливість зобразити битву між патогенами та господарем як у внутрішньому, так і в кольоровому плані.

Рибки даніо використовувались для моделювання інфекції для ряду бактерій, патогенних для людини, і зіграли свою роль у значному прогресі в нашому розумінні мікобактеріальної інфекції 3, 25. Однак це лише нещодавно, щоб набагато більші патогени, такі як гриби, використовувались для зараження личинка 5, 23, 26, і на сьогоднішній день не було детального візуального опису методології зараження. Тут ми представляємо наші методи для мікроін’єкції ромбенцефалічного шлуночка первинних даніо, включаючи наші модифікації попередніх протоколів. Наші результати з використанням моделі личинок даніо для грибкової інфекції розходяться з дослідженнями in vitro та підкріплюють необхідність вивчення взаємодії між господарем-патогеном у складному середовищі хазяїна, а не спрощеною системою чашки Петрі 5.

Протокол

Всі протоколи та експерименти з догляду за даніо проводились згідно протоколу A2009-11-01 Комітету з догляду за тваринами та інституційного використання (IACUC).

1. Морфолінові та личиночні ін’єкційні страви

Тривалість експерименту: * (10-15 хвилин)

Ступінь складності: *

  1. Для ін’єкцій яєць готуйте 2% розчин агарози у стерильній воді та мікрохвильовій печі. Коли розчин охолоне, вилийте трохи його в надглибоку чашку Петрі (Fisher Scientific), поки вона не заповниться наполовину. Дайте охолонути на льоду і переконайтеся, що сковорода рівна.
  2. Як тільки блюдо охолоне, залийте 15 мл верхнього шару 2% агарози. Розпиліть борозна із пластикової форми для ін’єкцій яєць (Adaptive Science Tools) стерильною водою з пульверизатора. Обережно помістіть борозенку стороною вниз у гарячу агарозну форму. Коли агар охолоне, використовуйте плоский металевий шпатель (VWR Scientific), щоб відокремити форму від збільшеного агару. Повільно зніміть сітку з агарози. Пластини для ін'єкцій ембріонів у парафільмі (VWR Scientific) та інвертованих магазинах при 4 ° C.
  3. Для ін’єкцій личинок риби готуйте 2% розчин агарози, як описано. Розлийте розчин у чашку Петрі стандартного розміру (VWR Scientific) і відставте, поки він не застигне. Оберніть посуд для ін’єкцій личинок у Парафільм та переверніть зберігання при 4 ° C.

2. Підготовка вирощування грибів

Тривалість експерименту: ** (30 хвилин)

Ступінь складності: **

3. Інфекції даніо

Тривалість експерименту: **** (1-3 години)

Ступінь складності: ****

4. Підготовка риби до візуалізації

Тривалість експерименту: ** (30 хвилин)

Ступінь складності: **

  1. Приготуйте розчин метансульфонату трикаїну, як і раніше (200 пг/мл). Вийміть заражену рибу та переведіть її на трикаїн.
  2. Приготуйте 47,9 мл 0,4% агарози з низькою температурою плавлення (Scientific VWR) в яєчній воді. Нагрійте розчин в мікрохвильовій печі. Охолодити до 37 ° C і до суміші додати метансульфонат трикаїну (200 пг/мл)
  3. Після того, як риба іммобілізована в метантрикаїнсульфонаті, піпетуйте кожну рибу в чашку Петрі (VWR Scientific), що містить 0,4% агарози з низькою температурою плавлення (VWR Scientific).
  4. Далі перемістіть агарозну рибу з низькою температурою плавлення в окремі лунки скляного нижнього посуду (MatTek Corporation) для візуалізації. Використовуйте якомога менше агарози як можна нижче для танення, щоб риба лежала рівно на дні миски. Не використовуйте достатньо трикаїну-агарози, щоб заповнити кола TNS у скляній нижній пластині.

5. Модифікації, пов’язані з протоколами Юпітера

Мікропіпетки для мікроін'єкції

Тривалість експерименту: * (10-15 хвилин)

Ступінь складності: *

  1. Витягніть порожнисті скляні стержні BF120-69-10 (Sutter Instruments) за допомогою полум'яного коричневого екстрактора мікропіпеток моделі P-97 (Sutter Instruments) згідно з Yuan et al. 30. Виберіть програму №7 з нагріванням за таких умов = 470, швидкість = 120, час = 200. Отримана голка знаходиться на 8 мм від фаски до кінчика, а при защіпці 3 мм над кінчиком вона має діаметр близько 10 мкм.
  2. Завантажте скляну мікропіпетку в тримачі. Виберіть "Витягнути". Нагрівальна нитка нагріває голку відповідно до програмних параметрів, і скляний стрижень розділяється на дві намальовані мікропіпетки. Мікропіпетки зберігають у коробці для зберігання піпеток (Suttinstruments er).

Збір ембріонів, ін’єкції та підтримка морфоліно

Тривалість експерименту: *** (1-2 години)

Ступінь складності: ***

Тривалість експерименту: ***** (1-5 годин)

Ступінь складності: ***

  1. Приготуйте агарозну рибу з низьким плавленням (відповідно до розділу 4.2) з трикаїном у нижньому скляному посуді для зображення (MatTek Corporation), як описано раніше. Помістіть блюдо на перевернутий мікроскоп Olympus IX-81 (Olympus). Помістіть рибу під фокус збільшення у 4 рази під світлом диференціального перешкоди (DIC). Зображення можна знімати в 4x, 20x, 40x, а також у параметрах фільтра DIC, TRITC (тетраметилродаміну ізотіоціанат) та FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат).
  2. Використовуйте інвертований мікроскоп Olympus IX-81 із системою лазерного сканування FV-1000 відповідно до конфокальної Ariga та співавт. 32. Організуйте часовий курс зі збільшенням у 40 разів, встановлюючи Z-стеки з фрагментами 1-1,5 мкм щогодини зараження.
  3. Для тривалого візуалізації 2 години або більше кладіть шар агарози з низькою температурою плавлення поверх риби в тарілку для зображення кожні 2-3 години. Це запобігає висиханню та подрібненню риби під час її зображення. Для тривалих курсів з невеликою кількістю риби використовуйте стадію нагрівання (Bioptechs Inc), щоб підтримувати 28 ° C під час інфекцій.

6. Репрезентативні результати

Приклад успішного зараження шлуночком заднього мозку C. albicans у личинки даніо через 5 годин після зараження (hpi) та 24 hpi наведено у (Фігура 1). Макрофаги-подібні клітини з поглиненою C. albicans видно в задньому шлуночку мозку при 5 hpi. На 24 hpi C. albicans знаходиться в макрофагоподібних клітинах у дорсальній тканині хвоста, що свідчить про дисемінований кандидоз. Цей результат зараження сильно залежить від точного введення 10-15 дріжджів у вигляді C. albicans у шлуночок заднього мозку. Це може забезпечити тестування на заражену рибу відразу після ін’єкції.

візуалізація
Фігура 1 трансгенний FLI1:. EGFP 22, 33 личинки, інфіковані CaF2-yCherry Candida albicans і інтравально зображені за допомогою конфокальної мікроскопії. (AC) 5 годин після зараження (A) Личинка, інфікована експресуючими EGFP макрофагоподібними клітинами в місці зараження (шлуночок заднього мозку) Шкала шкали = 100 мкм. (B і C) Збільшення зображення тих самих риб, що показує C. albicans у фагоцитах. Шкала шкали = 100 мкм для В і 10 мкм для С. (DF) 24 години після зараження (D) личинка, інфікована дисемінованим кандидозом CaF2-yCherry C. albicans всередині EGFP-макрофагоподібних клітин у спинній тканині хвоста. Шкала = 100 мкм. (E і F) Збільшені зображення тих самих риб, що показують C. albicans у тканинах хвоста. Шкала = 100 мкм.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Представлена ​​тут методика мікроін’єкцій даніо відрізняється від Gutzman et al. 34, ми демонструємо тут ін'єкцію через вушний пухирець у шлуночок заднього мозку 36-48 личинок HPF. Описаний нами метод дозволяє постійно вводити 10-15 дріжджів у шлуночок заднього мозку із зменшеним пошкодженням тканин. Цей протокол викликає інфекцію, яка спочатку поширюється локально по всьому тілу протягом 24 hpi (Фігура 1) і результати значної захворюваності/летальності 5. Задній шлуночок мозку повністю не закритий до 48 HPF 27, 29. На цій ранній стадії розвитку макрофаги та нейтрофіли мігрують до місця зараження, фагоцитують C. albicans і можуть рухатися до інших частин тіла 5.

Справжня сила цієї системи походить від здатності поєднувати її з трансгенними даніо, що експресують мікроби флуоресцентного білка. Ми розробили плями дикого типу та мутантів C. albicans для конститутивної експресії mCherry, dTomato та eqFP650. Поєднання цих експресійних конструкцій з промоторами, чутливими до окислювального стресу, дозволяє проводити раціометричну кількісну оцінку оксидативного стресу у живих 5 личинок даніо. Подвійне зображення in vivo флуоресцентних грибів та флуоресцентних вроджених імунних клітин як частини мутантного гриба. кількісно оцінити стійкі змінені імунні реакції, такі як міграція до місця зараження, фагоцитоз збудника, запобігання проростанню грибків та знищення 5.

До цього часу личинка даніо використовувалась для моделювання вродженої імунної відповіді на бактеріальні, грибкові та вірусні патогени 5, 26, 35-46. Ці новаторські дослідження встановили корисність цієї модельної системи для відкриття нових клітинних і молекулярних механізмів як господаря, так і збудника. Разом із цим описаним протоколом ці інші опубліковані роботи дають основу для інших лабораторій для вивчення взаємодії хазяїн-грибок у контексті неушкодженого господаря.

Хоча описана тут трансгенна лінія FLI1: EGFP, хоча і корисна в цих експериментах, має свої обмеження. Ген FLI1 експресується в ендотеліальній судинній системі, на додаток до макрофагоподібних клітин 22. Часто EGFP флуоресцирує із судинної системи, виявити C. albicans у макрофагоподібних клітинах може бути важко. Крім того, експресія EGFP у макрофагоподібних клітинах знижується приблизно через 18-24 години після зараження, що ускладнює виявлення. Нещодавно опублікована специфічна для макрофагів трансгенна лінія даніо має багато переваг як модель для досліджень макрофагів 23.

Описана методика зараження забезпечує введення в роботу ряду потужних засобів флуоресценції та генетичної мікроскопії, доступних у даніо. Його можна поєднувати з відповідними трансгенними та інженерними рибами C. albicans, щоб дозволити кількісно визначити багато аспектів взаємодії хазяїн-збудник, включаючи кількість нейтрофілів та макрофагів, що містять C. albicans, частоту перетравлення C Albicans та поділ C albicans у вроджені імунні клітини 5. Цей протокол також можна поєднувати із застосуванням антисмислових морфоліно-олігонуклеотидів для перевірки ролі різних вроджених імунних генів у інфекції 5.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Відсутність заявлених конфліктів інтересів.

Подяка

Автори висловлюють подяку лабораторії доктора Керол Кім за навчання мікроін'єкцій, Кларисі Генрі за поради щодо прискорення розвитку ембріонів та використанню обладнання та Натану Лоусону за внесок у рибу FLI1: EGFP. Ми дякуємо членам лабораторії Вілер та Шоуну Уоллз за критичне прочитання рукопису. Ми також хотіли б подякувати Марку Нілану за догляд та поради за рибою, а Райану Феніці та Крістін Габор за технічні поради щодо цього проекту. Цю роботу профінансували науковий співробітник MAFES Brothers K., грант MAFES Hatch E08913-08 та нагорода NCR N20R P20RR016463 Р. Вілеру.