Невеликі некодуючі РНК у регулоні двокомпонентної системи CiaRH у стрептококу

Невеликі некодуючі РНК у регулоні двокомпонентної системи CiaRH у Streptococcus pneumoniae Дисертація Dipl.-Biol. Затверджена кафедрою біології Технічного університету Кайзерслаутерна для присудження наукового ступеня доктора природничих наук. Марта Ковач Голова докторського комітету: проф. Маттіас Ган 1-й доповідач: проф. Реджин Хакенбек 2-й репортер: проф. Джон А. Каллум Дата наукової дискусії: 8 травня 2009 р. Кайзерслаутерн

регулоні

Ця робота проводилась на кафедрі мікробіології кафедри біології Технічного університету Кайзерслаутерн під керівництвом проф. Регіна Хакенбек зробила.

Цим я підтверджую, Марта Ковач, що я сам підготував цю роботу. Запевняю, що я використовував лише зазначені джерела та ресурси. Кайзерслаутерн, 17 березня 2009 р

Зміст Зміст Сторінка Зміст 1 Короткий зміст 5 Скорочення 7 1. Вступ 8 1.1 Streptococcus pneumoniae 8 1.2 Генетична компетентність та лізис Streptococcus pneumoniae 10 1.3 Двокомпонентна система CiaRH 13 1.4 Малі некодуючі РНК 16 1.5 Мета роботи 22 2. Матеріал 23 2.1 Штами бактерій 23 2.2 Плазміди 25 2.3 Олігонуклеотиди 26 2.4 Культуральні середовища 31 2.4.1 Середовище CpH8 31 2.4.2 Середовище THB 32 2.4.3 D Агар крові 32 2.4.4 Середовище LB 33 2.4.5 Середовище 2xTY 33 2.5 Використані антибіотики 34 3. Методи 35 3.1 Мікробіологічні методи 35 3.1.1 Документування росту бактерій 35 3.1.2 Умови культивування 35 3.1.3 Збереження штаму 36 3.1.4 Мікроскопія 36 3.1.5 Трансформація Streptococcus pneumoniae 36 3.1.6 Перевірка компетентності стрептококів . pneumoniae 37 3.1.7 Трансформація кишкової палички 37 1

Зміст 4.10 Дослідження впливу окремих csrnas на трансляцію comc 144 5. Обговорення 146 5.1 Регульовані CiaRH міжгенні промотори та їх транскрипти: 146 The csrnas 5.2 Стратегії пошуку генів-мішеней csrna 148 5.3 Валідація генів-цілей csrna in vivo 150 5.4 Взаємодія csrnas з мрнами їх цільових генів 153 5.5 Взаємозв'язок між CiaRH-асоційованими фенотипами 156 і csrnas 5.6 Подібні ефекти та механізми в інших організмах 163 5.7 Перспективи 165 6. Бібліографія 167 4

1. Вступ, здається, бере участь у регуляції позаклітинних адгезинів та секретованих факторів вірулентності (Kreikemeyer et al., 2001). Ще однією регуляторною РНК є локус пельми, який був виявлений шляхом аналізу бібліотеки транспозонів і був помітним за своїм плейотропним впливом на експресію екзопротеїнів. Ген РНК має довжину 459 п.н., ще один ген, сага, кодується між положеннями від 147 до 308 п.н. Однак можна було б показати, що нетранслірувана РНК, а не перекладений продукт SagA впливає на експресію факторів вірулентності (Mangold et al., 2004). Третя відома мала РНК - це RivX. Здається, ця РНК є продуктом обробки транскрипту rivrx. Хоча і тут у транскрипті є ORF, можна було показати, що РНК, а не білок, має регулюючий вплив на регульовані гени. Ця РНК викликає позитивний вплив на Mga-регульовані гени, що є важливим регулятором вірулентності (Roberts and Scott, 2007). 21-го

2. Матеріал 2.4 Культуральне середовище 2.4.1 Середовище CpH8 (середовище C) для культури Streptococcus pneumoniae У всіх дослідженнях, проведених у цій роботі, штами Streptococcus pneumoniae вирощували в середовищі CpH8 (Lacks & Hotchkiss, 1960). Окремі компоненти цього середовища виготовляли окремо і лише піпетували разом, коли це було потрібно. Окремі компоненти зберігали при 4 ° C без світла. Таблиця 2.17: Склад середовища CpH8 Кількість компонентів [мл] PreC 400 Добавка 13 Глютамін [1 мг/мл] 10 Адамс III 10 Піруват 2% 5 Фосфатний буфер 15 Дріжджовий екстракт 5% 9 Кінцевий об’єм 462 Таблиця 2.18: Склад окремих компонентів Компонент Додаткова кількість PreC Ацетат Na, безводні 1,2 г казамінокислот 5 г L-триптофану 5 мг L-цистеїну 50 мг H 2 O до 1000 мл добавки регулюють рН 7,5, солі 3 в 1 автоклаву 60 мл глюкози 20% (об/об) 120 мл сахарози 50% (мас./об.) 6 мл аденозину [2 мг/мл] 120 мл уридину [2 мг/мл] 120 мл компонентів автоклаву окремо, піпетують у стерильних умовах Адамс III Адамс I 160 мл Адамс II 40 мл аспарагіну 2 г холіну хлориду 0, 2 г CaCl 2 [0,1 М] 1,6 мл H 2 O і 1000 мл стерильної фільтрації та зберігати без урахування світла Фосфатний буфер ph8 KH 2 PO 4 [1 М] 53 мл K 2 HPO 4 [1 М] 947 мл автоклавування 31

2. Матеріал солей 3 в 1 Адамс I Адамс II MgCl 2 x6h 2 O 100 г CaCl 2, безводний 0,5 г MnSO 4 x4h 2 O [0,1 М] 0,2 мл H 2 O і 1000 мл автоклаву Біотин 0, 5 г нікотинової кислоти 150 мг піридоксину HCl 175 мг пантотенату кальцію 600 мг тіаміну HCl 160 мг рибофлавіну 70 мг H 2 O до 1000 мл стерильного фільтра і зберігати при виключенні світла FeSO 4 x 7h 2 O 500 mg CuSO 4 x5h 2 O 500 mg ZnSO 4 x7h 2 O 500 mg MnCl 2 x4h 2 O 200 mg HCl конц. H 2 O 10 мл на 1000 мл стерильної фільтрації та зберігати з вилученням світла 2.4.2 Середовище Тодда-Хьюітта (THB) Середовище Тодда-Хьюїта - це складне середовище, яке часто використовується для пневмококів, яке було отримано готовим до використання (Difco, Детройт, США). Середовище готували та автоклавували відповідно до інструкцій виробника. Таблиця 2.19: Склад середовища Тодда-Хьюіта Компонент Кількість бичачого серця (вливання свіжої тканини) 3,1 г пептону 20 г глюкози 2 г NaCl 2 г натрію карбонату 2,5 г динатрію фосфату 0,4 г 2,4,3 D кров’яного агару Як тверде середовище для Посів Streptococcus pneumoniae використовували D кров'яний агар. З цією метою D-агар автоклавували і після охолодження до 48 ° C додавали дефібриновану овечу кров (Oxoid) до кінцевої концентрації 3% (об./Об.). Після додавання будь-яких добавок, таких як антибіотики, суміш перемішували і виливали в стерильні чашки Петрі. 32

2. Матеріал Таблиця 2.20: Склад компонента D кров’яного агару глюкоза бактопептон неопептон дріжджовий екстракт NaCl Трис агар H 2 O кількість 1 г 10 г 5 г 1,25 г 5 г 1,25 г 15 г до 1000 мл середовища 2.4.4 LB Середовище Lauria-Bertani (LB) використовували для культивування кишкової палички (Sambrook et al., 1989). Для отримання агару LB до середовища додавали 15 г/л агару. За необхідності додавали відповідні антибіотики та інші добавки. Таблиця 2.21: Склад середовища LB Компонент Кількість бактопептону 10 г NaCl 5 г екстракту дріжджів 5 г H 2 O до 1000 мл 2.4,5 2xTY середовище Середовище 2xTY використовували для виділення меншої кількості плазміди з E. coli. Таблиця 2.22: Склад середовища TY Компонент Кількість Бактопептон 16 г NaCl 5 г дріжджового екстракту 5 г H 2 O до 1000 мл 33

2. Матеріал 2.5 Використані антибіотики Антибіотики, узагальнені в таблиці 2.23, додавали до твердих та рідких середовищ за необхідності. Після їх приготування вихідні розчини стерильно фільтрували і зберігали при -20 ° С. Таблиця 2.23: Використані антибіотики Розчинник антибіотиків Концентрація вихідного розчину Тетрациклін 50% EtOH 3 мг/мл 3 мкг/мл Кінцева концентрація Ампіцилін H 2 O 20 мг/мл 100 мкг/мл Спектиноміцин H 2 O 20 мг/мл 80 мкг/мл Стрептоміцин H 2 O 20 мг/мл 200 мкг/мл Еритроміцин 90% EtOH 1 мг/мл 1 мкг/мл Канаміцин H 2 O 20 мг/мл 200 мкг/мл Хлорамфенікол H 2 O 1 мг/мл 1 мкг/мл 34

4. Результати 1.0 Ефективність трансформації% 0,8 0,6 0,4 0,2 R6 RK12345 RK123 RK45 R6 ciar: aad9 0,0 0 20 40 60 80 100 120 Щільність клітин [NU] Рисунок 4.24: Ефективність трансформації різних ccn делеційні штами порівняно з диким типом S. pneumoniae R6 та S. pneumoniae R6 ciar: aad9. Щільність клітин в одиницях нефело показано на осі X. Ефективність трансформації у відсотках (частка трансформованих клітин у кількості живих мікробів) знаходиться на осі Y. Дикий тип R6 чорний, RK12345 - червоний, RK123 - зелений, RK45 - темно-синій, а S. pneumoniae R6 ciar: aad9 показаний світло-блакитним. Результати дослідження природної трансформабельності штамів RK12345, RK123 та RK45 вказують на зв'язок між малими некодирующими РНК та природною трансформативністю S. pneumoniae R6. Всі три досліджувані штами продемонстрували знижену трансформабельність. Цей фенотип неможливо спостерігати при R6 ciar: aad9. Визначити зсув піку компетентності можна було лише у напрямку меншої щільності клітин. Вісімкратне зменшення трансформабельності штаму RK12345 суперечить повній трансформабельності штаму з видаленим циаром. 105

4. Результати 4.7.3 Визначення активності ß-галактозидази цільового гена - злиті білки LacZ як функція csrnas Активність цільового гена - злиті білки lacz як функція csrnas визначали за допомогою аналізів ß-галактозидази. Для цього плазміди вводили в геном дикого типу S. pneumoniae R6 та мутанта csrna S. pneumoniae RK12345. Активність β-галактозидази вимірювали за допомогою цільноклітинних лізатів відповідних штамів. Вимірювання проводили в середній експоненціальній фазі при щільності клітин Nephelo 80 і незабаром після вступу в стаціонарну фазу. Результати вимірювань наведені на рисунку 4.30. R6 RK12345 20 T3comA 50 40 T3hsdS ß-Gal одиниці 15 10 5 ß-Gal одиниці 30 20 10 0 0 exp. Стадія фази Екс. Фази Стадія фази Фазові одиниці ß-Гал 80 60 40 20 T3spr1610 Агрегати ß-Гал 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 T3comC 1000 0 досвід. Стадія фази Фаза 0 Стадія фази Фаза 800 700 600 T3spr0081 8000 7000 6000 T3cibB ß-Gal одиниці 500 400 300 ß-Gal одиниці 5000 4000 3000 200 2000 100 1000 0 доз. Стадія фази Фаза 0 Стадія фази Фаза 125

4. Результати 700 600 T3spr0231 200 180 160 T3blpY ß-Gal одиниці 500 400 300 200 100 ß-Gal одиниці 140 120 100 80 60 40 20 0 досвід. Стадія фази Фаза 0 Стадія фази Блоки фази ß-Гал 400350300250200150 T3spr0822 Агрегати ß-Гал 50 40 30 20 T3spr1932 100 50 10 0 0 екс. Стадія фази Екс. Фази Стадія фази Фаза 20 T3spr0265 80 T3spr1645 15 60 Одиниці ß-Гал 10 Одиниці ß-Гал 40 5 20 0 екс. Стадія фази Фаза 0 Стадія фази Фаза 1000800 PvegT ß-Gal одиниці 600400 R6 RK12345200 0 Стадія фази Фаза Рисунок 4.30: Активність β-галактозидази 12 клонованих генів-мішеней - злиті білки lacz у дикому типі S. pneumoniae R6 та у S. pneumoniae RK12345. Вимірювання проводили у два моменти часу: в експоненціальній фазі при щільності клітин Nephelo 80 і незабаром після вступу в нерухому фазу. Одиниці визначаються як нмоль, що виділяється ONP/хв/мг білка. Показані засоби щонайменше 2 незалежних експериментів. Діяльність цільового гена - злиті білки lacz у середовищі C позначена чорним кольором для S. pneumoniae R6 та червоним для S. pneumoniae RK12345. В якості контролю в обох штамах визначали промоторну активність P vegt. 126

4. Результати Рисунок 4.39: Аналізи зсуву смуги та аналіз Норт-блот-комплексів комплексів взаємодії comc-rna та csrna3. На малюнках вище показано гелі для переключення смужок SYBRGreenII. Завантаження гелю виконується, як описано раніше. Смуги взаємодії позначені червоними стрілками. На малюнках нижче зображені промокані гелі. На лівій картинці для виявлення використовували зонд, специфічний для csrna3. На правій картинці мембрана була розрізана і comcbzw. використовувані специфічні зонди htra. Промокані смуги взаємодії позначені червоними стрілками. Аналіз взаємодії з spr0081 Аналіз взаємодії проводили з усіма 5 кСНК. Чіткі смуги взаємодії можна виявити в csrna2, csrna3, csrna4 та csrna5. У той же час на цих коліях можна було спостерігати зникнення spr0081-rna на її фактичній висоті ходьби. У csrna1 не було видно чітких діапазонів взаємодії, і смуга spr0081 теж не змінилася. Таким чином, spr0081-rna не утворював комплексу взаємодії з csrna1. Тут також csrna1 утворив смуги приблизно вдвічі більшу висоту (рис. 4.40, смуга 5). Ці смуги також були помічені в останніх слідах негативного контролю. 142

5. Обговорення 5. Обговорення 5.1. Інтергенні промотори, що регулюються CiaRH, та їх стенограми: csrnas. Інтергенні промотори, регульовані CiaRH, сильно залежать від CiaR. Без функціонуючого регулятора реакції практично немає вираження (Halfmann et al., 2007). Діяльність цих промоутерів наведена в таблиці 5.1. Таблиця 5.1: Активність β-галактозидази в результаті регульованих CiaRH інтергенних промоторів Промотори R6 ciar: aad9 R6 (wt) R6 ciaht230p P ccnc