Очищення білка - біологія

Очищення білка (також Очищення білка) описує процес збагачення та очищення одного або декількох білків із складної біологічної суміші або розчину, що містить кілька біомолекул. Це збагачення може відбуватися у кілька послідовних етапів очищення, використовуючи різні методи очищення, ефективність яких (значуща послідовність) та їх ефективність (ступінь очищення) контролюються та визначаються кількісно аналітичними методами.

Принципи розділення

Для того, щоб розділити білки, можна скористатися різними їх характеристиками завдяки послідовності та специфічній структурі. При іонообмінній хроматографії та ізоелектричному фокусуванні це ізоелектрична точка, у SDS-PAGE - молекулярна маса та посттрансляційні модифікації, за винятком розміру хроматографії та центрифугування молекулярної маси та конформації. Ізопічне центрифугування відокремлюється на основі щільності. Афінна хроматографія використовує різницю в спорідненості до селективного ліганду або у відповідних константах дисоціації. Гідрофобна, зворотна фаза та полярна хроматографія розділяються відповідно до полярності різних відкритих полярних амінокислот та посттрансляційних модифікацій. Опади космотропними солями [1] із серії Хофмайстера, водорозчинними органічними розчинниками або температурою засновані на зміні розчинності. Екстракція екстрагентом (зазвичай іншою фазою) або поліетиленгліколем [1] заснована на полярності та різній розчинності в розчиннику або миючому засобі, наприклад. B. Суміші фенолу, хлороформу та ізоамілового спирту (з хаотропами або без них, такі як тіоціанат гуанідинію [2]), або фазовий поділ одновідсоткових (м/об) розчинів Тритон Х-114 при 4 ° C. [3] [4] [5] [6]

Зазвичай кілька методів проводять послідовно, вибір методу залежить від властивостей білка, відповідного методу, що заважає супутнім речовинам для подальших процедур та будь-якої пов'язаної з ним денатурації. Більш високі ступені очищення (або фактори очищення) процесу дозволяють меншу кількість етапів очищення, наприклад Б. з тандемним очищенням спорідненості.

Оскільки білки, що підлягають очищенню, переважно рекомбінантні білки, знаходяться під загрозою внаслідок інактивації, денатурації або протеолізу під час руйнування клітин, очищення білка часто проводиться швидко при 4 ° С у присутності інгібіторів протеази. Деякі інгібітори протеази використовуються лише в тому випадку, якщо функція протеїну, що очищається, не порушена або підтримка його функції незначна, оскільки вони можуть модифікувати білок за допомогою ковалентного зв'язку.

Процес розділення

Хроматографія

Іонообмінна хроматографія (IEX)
Хроматографія виключення розміру (SEC)
Афінна хроматографія
полярна хроматографія
Гідрофобна взаємодія хроматографії (HIC) та зворотно-фазова хроматографія (RPC)

Електрофорез

Видобування та опади

серійні витяжки
серійні опади

Фільтрація

діаліз
Фільтрація тангенціального потоку
Мікрофільтрація

седиментація

Центрифугування
Аналізи на розрив
за допомогою антитіл: MACS, аналізи з бісеру та імунопреципітація

Випаровування

Процедура перевірки

Після окремих етапів очищення білка, очищені білки характеризують і визначають кількісно. Ефективність усього очищення визначається балансом із ступенем очищення (як зворотна масова частка) від маси білка, або - у випадку з ферментами - також ступінь очищення може бути визначена на основі активності ферментів, напр. B. коефіцієнт загальної маси очищеного білка та вихідна маса відповідного білка у вихідному матеріалі або аналогічний коефіцієнт, утворений в результаті активності.