Пренатальне виявлення криптичних перестановок шляхом ампліфікації зонда мультиплексного лігування

криптичних

  • Анотація
  • Головна
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Пацієнти
  • Посилення за допомогою мультиплексного зонду для перев'язки
  • Флуоресценція in situ гібридизація
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Пацієнт А
  • Пацієнт Б
  • Пацієнт С
  • Пацієнт D
  • ОБГОВОРЕННЯ

Анотація

Завдання: Вроджені вади розвитку є основною причиною захворюваності та смертності новонароджених, а геномний дисбаланс є важливою частиною їх етіології. Метою цього дослідження було оцінити здатність пренатального скринінгу ампліфікації зонда для мультиплексної лігації перед пренатальним шляхом виявляти дисбаланс криптичної хромосоми у плодів з ультразвуковими аномаліями невідомої етіології.

Методи: Ампліфікацію мультиплексного зв’язувального зонда проводили за допомогою трьох окремих наборів зондів: двох для субмеломерних областей та одного для локусів синдрому розумової відсталості. Шістдесят один плід із значними відхиленнями від ультразвуку та нормальним каріотипом з мінімальною роздільною здатністю 400 смуг був протестований між січнем 2007 та січнем 2009 р.

Результати: Ми виявили чотири незбалансованих перегрупування: мікроделеція 18пт/ампер 5пт, мікроделеція 9пт, мікроделеція 15q11q13 та мікроделеція 22q11 нетипово. Після генетичного консультування дві вагітності були перервані.

Висновок: Аналіз за допомогою ампліфікації зонда мультиплексного лігування виявив клінічно значущі перебудови у 6,5% плодів з ультразвуковими відхиленнями, виявленими до народження. Це проспективне дослідження підкреслює, що скринінг шляхом ампліфікації з допомогою мультиплексного зв’язувального зонда плодів з ультразвуковими аномаліями в пренатальному періоді є технічно здійсненним та важливим для діагностики та прогнозу.

Головна

Вроджені вади є основною причиною захворюваності та смертності у новонароджених і діагностуються приблизно у 3% населення. Деякі вроджені вади виявляються за допомогою УЗД під час пренатального періоду. Стандартний каріотип, отриманий шляхом відбору проб ворсин хоріона або амніоцентезу, виявляє хромосомні аберації у 18 - 35% уражених плодів. 1, 2 Для збільшення цієї швидкості виявлення використовуються методи з високою роздільною здатністю, засновані на флуоресценції гібридизації in situ (FISH), порівняльної геномної гібридизації (метафаза з розповсюдженням або решітка-CGH) та кількісні методи мультиплексної ланцюгової реакції на багатоланцюжних (ПЛР), такі як ) або застосовували кількісну мультиплексну ПЛР коротких фрагментів, але їх використання в пренатальній діагностиці залишається обмеженим.

Вже було показано, що риба, характерна для теломерів, є корисним інструментом для виявлення делецій та дублювань у плодів з основними вадами розвитку. 3, 4 Нещодавно було встановлено, що матричний CGH-аналіз зразків плода для виявлення низьких змін кількості ДНК змінив. 5 - 8 MLPA - це швидкий та економічно ефективний метод скринінгу на асиметричні незбалансовані субтеломерні перебудови та інтерстиціальні дисбаланси, розташовані в зонах, пов’язаних з розумовою відсталістю (синдром розумової відсталості [MRS] -MLPA). Це тому, що MLPA вимагає менше 2 днів, а результати MLPA можуть бути доступні через 3 дні (через 4 дні, якщо потрібно тестування на FISH). На сьогоднішній день лише в одному дослідженні поєднано MRS-MLPA з субтеломерним MLPA, що покращило рівень виявлення дисбалансу з 5,8% до 10,1% у дітей з розумовою відсталістю. 9

У цьому дослідженні досліджено 61 плід із нормальним каріотипом та ультразвуковими порушеннями, що свідчить про хромосомні аберації з використанням MLPA та субтеломерних MRS-MLPA. Наскільки нам відомо, це перший звіт про використання субтеломерного MLPA у поєднанні з MRS-MLPA, що використовується як метод проспективного пренатального скринінгу при діагностичній оцінці плодів з ультразвуковими аномаліями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Пацієнти

Шістдесят один плід з одним або кількома вадами розвитку, що свідчать про хромосомні аномалії та нормальний каріотип, були включені в наше проспективне дослідження з січня 2007 року по січень 2009 року (Таблиця 1). Для кожного плоду з амніотичної рідини або ворсин хоріона проводили каріотип з роздільною здатністю 400 смуг із смугами RHG та GTG. У разі серцевих відхилень виконували 22q11.2 FISH. Коли результати каріотипу та FISH були нормальними, ми запропонували пацієнтам продовжувати цитогенетичні дослідження за допомогою MLPA. Усі 61 пацієнт погодився взяти участь у дослідженні та отримав відповідну інформовану згоду. Дослідження проводилось у повній відповідності з принципами Гельсінської декларації.

Повний розмір таблиці

Посилення за допомогою мультиплексного зонду для перев'язки

Сто двадцять нанограм ДНК використовували в протоколі MLPA відповідно до інструкцій виробника. Реакції проводились на професійному професійному термоциклері (Biometra, Archamps, Франція). Три мікролітри продуктів ПЛР аналізували за допомогою капілярного електрофорезу на генетичному аналізаторі ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, Courtabeouf, Франція), а кількісні дані витягували за допомогою програмного забезпечення ABI Prism GeneScan Analysis та програмного забезпечення Genetyper (Applied Biosystems). Аналіз даних MLPA проводили за допомогою Microsoft Excel. Пацієнт із незбалансованою транслокацією t (10; 18) (qter; qter) та пацієнт із делецією 15q12 були включені як позитивні контролі в кожен аналіз MLPA P036/P070 та P245, відповідно, з негативним контролем. Аномальні результати були визначені як більше ніж 1,3 для посилення та менше 0,7 для втрати генетичного матеріалу.

Флуоресценція in situ гібридизація

Ненормальні результати, отримані MLPA, були підтверджені FISH на метафазних хромосомах згідно із стандартними процедурами (Cytocell Technology або Vysis, Inc., Downers Grove, IL) з використанням зондів, розташованих у підозрілих регіонах та контрольних зондах. Лімфоцити периферичної крові батьків аналізували FISH, коли тестований плід був позитивним щодо перебудови.

РЕЗУЛЬТАТИ

Ми виявили криптичний дисбаланс у чотирьох із 61 плоду (6,5%), досліджених MLPA. Виявлено дві субтеломерні перебудови та дві перицентромерні мікроделеції. Клінічні та цитогенетичні дані цих чотирьох випадків представлені нижче.

Пацієнт А

Звіти про аналіз генів на субеломерні MLPA та MRS-MLPA. A, зонди SALSA P036 (ліворуч) та P070 (праворуч) набір аналізів для плода A, що показує 5p ампліфікацію теломер та придушення теломер 18q. B, зонд SALSA P036 (ліворуч) та P070 (праворуч) набір аналізів для плода B, що показує делецію 9р теломер. C, Звіт про аналіз наборів зондів SALSA P036 (ліворуч) та P070 (праворуч) для плода C, що показує видалення області 15q11.2. D, звіт про аналіз зонду плоду SALSA P245 D, що показує видалення трьох зондів, націлених на область 22q11.21.

Повнорозмірне зображення

Пацієнт Б

Пацієнт С

Пацієнт D

ОБГОВОРЕННЯ

Завданням цього дослідження було оцінити технічну доцільність та корисність виконання МЛП протягом пренатального періоду. Наскільки нам відомо, це перше дослідження для оцінки MRS-MLPA, асоційованого з субтеломерним MLPA, при пренатальному діагностичному скринінгу плодів з патологічним УЗД невідомої етіології.

Ми виявили чотири субмікроскопічні перестановки за допомогою трьох різних наборів зондів MLPA у 61 плода, направленого до нашої лабораторії на ненормальне ультразвукове дослідження. FISH підтвердив цей дисбаланс щодо метафазних відхилень.