Протокол диференціації клітин периваскулярних жирових клітин аорти аорти людини (переклад

Резюме

Метою цього протоколу є перевірити здатність клітин-попередників, отриманих із жирової тканини периваскулярної тканини людини, диференціюватись на кілька ліній клітин. Диференціацію порівнювали з мезенхімальними стовбуровими клітинами кісткового мозку людини, які, як відомо, диференціюються на лінії клітин адипоцитів, остеоцитів та хрящів.

Анотація

Вступ

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Використання людських тканин у цьому дослідженні було оцінено та схвалено Інституційною комісією з огляду Медичного центру Мен, і весь персонал пройшов відповідну підготовку до експериментів.

2. Протокол 1: Культура клітин PVAT людини з розриву судини строми

Примітка: ПВАТ резекується з місця анастомозу трансплантата у висхідну аорту у пацієнта, який знеболюється, з аортокоронарною аортопластикою. Аортальний ПВАТ поміщають у 15 мл конічну коницю з 10 мл крижаного холоду з високим вмістом глюкози DMEM-F12 і передають у лабораторію протягом 2 годин після резекції з операційної. ПВАТ аорти викидають тканини під час байпасних процедур і проводяться як дослідження, що не є людиною, відділом внутрішнього аудиту Медичного центру Мен.

Цей протокол призначений для

500 мг шматочка людського ПВАТ (приблизно 3 х 1 х 0,5 см 3). Перенесіть свіжий ПВАТ людини з DMEM у конічну пробірку на 50 мл, що містить 25 мл розчину антибіотика. Інкубуйте з горючими речовинами протягом 20 хв при 4 ° C. Поки PVAT знаходиться в розчині антибіотика, розморозьте аликвоту дисоціаційного буфера при 37 ° C. Додайте 5 мл дисоціаційного буфера 50 мкл 100 х антибіотичного/протигрибкового розчину та стерилізуйте шприцевим фільтром 0,22 мкм. 1 також додайте 1 мл розчину желатину з 24-лункової тарілки. У капюшоні з ламінарним потоком використовуйте стерильний пінцет та ножиці, щоб перенести ПВАТ з розчину антибіотика в стерильну чашку Петрі. Додайте до тканини 1 мл попередньо розігрітого дисоціаційного буфера і дрібно наріжте всю тканину в кашку (жоден шматок не більше

Додайте 1 мл свіжого культурального середовища і розподіліть 500 мкл, 2 лунки з 24-лункової платівки, кожна з 500 мкл середовища для росту і 25 нг FGF2.

Крім того, клітини, отримані від людського PVAT, продовжують розширюватися, як зазначено на попередньому етапі. Кожен уривок не повинен бути більшим, ніж розділення 1: 2. Клітини пассируют 5-7 разів перед тим, як їх розподіляють для аналізів на диференціацію.

3. Протокол 2: Культура колоній MSC кісткового мозку людини

Примітка: MSC кісткового мозку людини виділяють, як описано 8, і зберігають як запаси для раннього проходження в заморожених морозильних середовищах (70% FBS, 20% базальної DMEM і 10% DMSO)

100 000 клітин/мл у рідкому N2.

1. Швидко розморозьте флакон кісткового мозку MSC від рідкого N2 на водяній бані та платівці з температурою 37 ° C до лунки 6-лункової культуральної пластини з 3 мл середовища для росту MSC та інкубуйте протягом ночі при 37 ° C та 5% CO2.
2. Наступного дня відсмоктуйте культуральний середовище MSC і промийте клітини 3X у 2 мл HBSS. При 100% злиття аспіруйте середовище для росту та промийте клітини 3X у 2 мл HBSS. Додайте 500 мкл/лунку розчину для відшарування клітин та інкубуйте при температурі 37 ° C та 5% CO2 протягом 5 хв. Постукайте по тарілці, щоб забезпечити витіснення всіх клітин та вміст у 6-лунковому планшеті з рівномірним рівнем 2 мл середовища для росту MSC у 2 лунках. розподіляти.
3. Розширювати в кістковому мозку людини та отриманому ПВАТ МСК паралельно протягом приблизно 5 - 7 пасажів або до досягнення достатньої кількості для тестування.

4. Протокол 3: Вимірювання та індукування адипогенних, остеогенних та хондрогенних ліній

Відповідна кількість пластинок клітин кісткового мозку та PVAT, отриманих на лунку 12-лункової пластини та відтворених відповідно до кожного експериментального стану. Для адипогенних та остеогенних станів,

5. Протокол № 4: Культура адипогенних, остеогенних та хондрогенних ліній протягом 14 днів

6. Протокол No 5: фарбування адипогенного стану олійно-червоним О

7. Протокол 6: фарбування остеогенного стану алізариновим червоним

1. Видаліть всю рідину з кожної лунки. Додайте відповідні обсяги 2% розчину азаринового червоного плями в кожну лунку (1,5 мл на лунку для 12-лункової пластини) і обережно нахиліть пластину з боку в бік, поки розчин повністю не покриє дно лунки.
2. Інкубуйте протягом 15 хв при кімнатній температурі. Видаліть із криниці алізариновий червоний. Промийте кожну лунку чотири рази дистильованою водою, обережно, щоб акуратно не витіснили кристали кальцію. дати висохнути.

8. Протокол 7: Фарбування хондрогенного стану трихромом Массона

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Виділення судинної фракції стромальних клітин від PVAT людини

Малюнок 1А показує схематичне зображення анатомічної області, яка перекривала висхідну аорту PVAT. Групи пацієнтів під час аортокоронарного шунтування ці зразки, отримані з 6, були описані раніше - Рисунок 1b наведено приклад ПВАТ людини, отриманого після операції. ілюстрація 1 показаний репрезентативний зріз тканини PVAT, забарвленої плямою Masson Trichrome. ілюстрація 1 являє собою фазову контрактну мікрофотографію, що показує популяцію стромальних клітин, отриманих PVAT, під час фази розширення до диференціювання. Клітини можна розширити та заморозити для подальшого використання. Клітини зазвичай мають щільність 2,5 х 105 клітин/мл у середовищі, що складається з 70% замороженого FBS, 20% базального (без антибіотиків) DMEM-F12 і 10% DMSO в ізопропанольній камері. 80 ° C протягом 24 год і переміщений у рідку фазу рідкого морозильника N2 для тривалого зберігання.

Адипогенна диференціація

MSC паралельний кістковому мозку людини (рис. 2АB.) та клітини-попередники, отримані від PVAT (рис.2Д.) були проведені дослідження. Ліві панелі на малюнку 2 показати індукований стан, коли не спостерігається скупчення ліпідів. Правильні пластини показують клітини шляхом диференціювання адипоцитів та фарбування нейтральних ліпідів олійно-червоним О. Хоча ступінь диференціації в аортальному клапані людини є більш надійною у клітинах, отриманих PVAT, обидва джерела демонструють здатність клітини людини диференціюватись у напрямку адипогенного походження.

Остеогенна диференціація

Протокол остеогенної диференціації застосовувався до MSC, отриманого з кісткового мозку людини (рис. 3А-C.) та клітини, зібрані за допомогою PVAT (рис. 3D- Ф) використовується. Неіндуковані клітини (рис. 3АД.) не фарбувати червоний колір алізарином. Відповідно до протоколу остеогенної диференціації, MSC людини розробив кальцифіковані вузлики, які були пофарбовані в червоний колір алізарином (рис. 3b- С), тоді як клітини, отримані від PVAT аорти людини, цього не роблять (Малюнок 3E-Ф.). Ці дані свідчать про те, що в нашій підготовці клітин із розриву судин строми людського PVAT не вистачає численних предків, здатних проходити остеогенез. Залежно від дослідження та часового курсу диференціації доцільно спостерігати за стандартними плямами з виявленням молекулярних маркерів, що визначають залучення кісткоутворювальної лінії (наприклад, RUNX2, Остерікс, лужна фосфатаза) або остеобластів (остеопонтин, остеокальцин, лужна фосфатаза, BAP1).

Хондрогенна диференціація

Клітини з обох MSC кісткового мозку людини (рис. 4А) похідний та людський PVAT (Рисунок 4b) виявляють особливості, характерні для хондрогенної диференціації, з великим накопиченням колагену в мікромасі. Мікромаси, утворені з MSC кісткового мозку людини та клітин, отриманих з PVAT аорти, також виявляли рясні скупчення глікозаміногліканів (синього кольору), як вказує фарбування на синьому алкіані (малюнок 4-Д., відповідно). Морфологічно структури були схожі на проміжки з посадкою в порожнинах, створених в результаті осадження колагену (рис.4, Стрілки) навколишні клітини. Залежно від дослідження та часового курсу диференціації корисним є виявлення певних хондрогенних маркерів (агрекан, колаген типу II, остеонектин, Sox9).

Рисунок 1: Морфологічні характеристики PVAT людини. (А.) Мультфільм зображення аорти людини (червоний) з навколишнім PVAT (жовтий). Стрілка показує висхідну аорту. (B.) шматочок PVAT аортального клапана людини у 480 мг від пацієнта з АКШ у DMEM перед дисоціацією. (C.) Фіксоване у формаліні Масоном парафінове вроджене трихромне пляма людини PVAT (темно-коричневий/чорний = ядра, синій/фіолетовий = сполучна тканина, рожевий = цитоплазма; зверніть увагу, що еритроцити виглядають червонувато-рожевими.)Д.) Репрезентативне зображення експлантованих стромальних клітин PVAT через 7 днів у культурі. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Рисунок 2: адипогенна диференціація. (А.) Фазова мікроскопія МСК кісткового мозку людини в неіндукованому стані не свідчить про диференціацію. (B.) Фазова мікроскопія МСК кісткового мозку людини в індукованому адипогенному стані показує деяку диференціацію та іммобілізацію нейтральних ліпідів, забарвлених олійно-червоним О через 14 днів. (C.) Фазова мікроскопія клітин аорти людини, отриманих PVAT, у неіндукованому адипогенному стані не свідчить про диференціацію. (Д.) Фазова мікроскопія клітин аорти, отриманих PVAT людини в індукованому адипогенному стані, показує стійку диференціацію та іммобілізацію нейтральних ліпідів, забарвлених олійно-червоним О через 14 днів. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 4: Хондрогенна диференціація. (A, B) Світлова мікроскопія ділянки мікромаси, утвореної MSC (A) кісткового мозку людини або клітин-попередників PVAT аортального клапана людини (B) в індукованому хондрогенному стані через 14 днів у культурі і згодом забарвленого трихромом Массона, що свідчить про значне відкладення колагену (синього) та передбачає успішну диференціацію до хондрогенного походження. (C, D) Світлова мікроскопія ділянки мікромаси, утвореної MSC (C) кісткового мозку людини або клітин-попередників PVAT аортального клапана людини (D) в індукованому хондрогенному стані через 14 днів у культурі, а потім забарвлюється в синій колір Alcian, припускаючи відкладення кислих протеогліканів (наприклад, B. глікозаміноглікани), ніж зазвичай містяться в хрящі. Контраст, ядерно-червоний стрімко; Стрілки, щілиноподібні конструкції. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Стовбурові клітини жирової тканини стали зосередженими на застосуванні регенеративної медицини завдяки легкому доступу та великій кількості клітин, які можна отримати з жирової тканини 12, 13. Судинні клітини, запальні клітини, фібробласти, преадипоцити та стовбурові клітини жирової тканини - це судинна частина жирової тканини стромальних клітин. Існують відмінності в популяції стовбурових клітин на основі анатомічного розташування жирового депо та властивостей адипоцитів 14. Найголовніше, що похідні жирової тканини стовбурові клітини, здається, здатні диференціювати не тільки мезенхімальні лінії 15, але й потенціал приймати долі нейронів 16, 17 та епідермісу 18.

Численні дослідження зосереджувались на стовбурових/попередницьких клітинах, отриманих із підшкірної білої жирової тканини людини, але мало досліджень розглядали властивості популяцій попередників PVAT. Недавні дослідження дозволили виділити клітини-попередники адипоцитів із PVAT, що оточує брижеві судини або грудну аорту щурів. Хоча ці популяції CD34 +/CD140a + диференціюються в адипоцити, здатність проводити інші лінії не перевірялася 19 .

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори нічого не розкрили.

Подяка

Ми визнаємо підтримку навігаційних досліджень в Медичному центрі штату Мен у допомозі в отриманні клінічної тканини та ядра гістопатології та гістоморфометрії (за підтримки 1P20GM121301, L. Liaw PI) в Науково-дослідному інституті з вирізання та фарбування в Медичному центрі штату Мен. Цю роботу підтримав NIH Grant R01 HL141149 (L. Liaw).

---