Регуляція аутоімунних захворювань через поліморфізм КТП PTPN та ген NCF1

З Інституту клінічних досліджень мозку Герті Тюбінгенського університету Департамент загальної неврології виконуючий обов'язки медичного директора: професор д-р А. Регулювання аутоімунних захворювань Мелмса за допомогою поліморфізму PTPN22 1858 * C/T та структури гена/псевдогену NCF1 вступна дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медицини медичного факультету Тюбінгенського університету ім. 2010 рік

Декан: професор доктор I. B. Autenrieth 1-й доповідач: професор д-р Лікар. Р. Вайсерт 2-й доповідач: професор д-р Т. Гассер

Зміст 1 Список скорочень 1 2 Вступ та запитання 3 2.1 Складні генетичні аутоімунні захворювання 3 2.1.1 Визначення та епідеміологія 3 2.1.2 Етіологія та патогенез 3 2.2 Нерецептор міастенії та білка тирозинфосфатази 22 6 2.2.1 Міастенія 6 2.2.1.1 Визначення 6 2.2.1.2 Епідеміологія 6 2.2.1.3 Симптоми 6 2.2.1.4 Перебіг 7 2.2.1.5 Міастенія новонароджених 8 2.2.1.6 Супутні захворювання 8 2.2.1.7 Нейромускулярне передавання 8 2.2.1.8 Патогенез 10 2.2.1.9 Значення тимусу 11 2.2.1.10 клінічні класифікації та оцінки 12 2.2.1.10.1 Класифікація за Оссерманом та Генкінсом 12 2.2.1.10.2 Оцінка міастенії Гравіса за Безінгером 13 2.2.1.11 Діагностика 13 2.2.1.11.1 Фармакологічне тестування 13 2.2.1.11.2 Повторна стимуляція за допомогою електроміографії 13 2.2.1.11.3 Діагностика антитіл 14 2.2.1.12 Терапія 15 2.2.1.12.1 Інгібітори ацетилхолінестерази 15 2.2.1.12.2 Імунодепресивна терапія 16 2.2.1.12.3 Тимектомія 16 2.2.2 Нерецептор білкової тирозинфосфатази 22 17 2.2.3 Питання для дослідження 18 2.3 Розсіяний склероз/малярія та цитозольний фактор нейтрофілів 1 19 I.

2.3.1 Розсіяний склероз 19 2.3.1.1 Визначення 19 2.3.1.2 Епідеміологія 19 2.3.1.3 Картина захворювання 20 2.3.1.4 Форми курсу 20 2.3.1.5 Діагностичні критерії 21 2.3.1.6 Прогноз 24 2.3.1.7 Патогенез 25 2.3.1.8 Діагностика 27 2.3.1.8. 1 Діагностика СМЖ 27 2.3.1.8.2 Електорфізіологічна діагностика 28 2.3.1.8.3 Магнітно-резонансна томографія 28 2.3.1.8.4 Ваги для оцінки інвалідності 28 2.3.1.9 Терапія 28 2.3.2 Малярія 31 2.3.2.1 Визначення 31 2.3.2.2 Епідеміологія 31 2.3 .2.3 Цикл розвитку паразита 31 2.3.2.4 Симптоми 32 2.3.2.5 Терапія 33 2.3.3 Реактивні метаболіти кисню 33 2.3.4 Нейтрофільний цитозольний фактор 1 35 2.3.4.1 Визначення 35 2.3.4.2 Оксидаза НАДФН 35 2.3.4.3 Ген CF1 та псевдогени 36 2.3.4.4 NCF1 та аутоімунні захворювання 40 2.3.5 Дослідницьке питання 40 3 Матеріал та методи 41 3.1 Міастенія гравіс та PTPN22 41 3.1.1 Пацієнти 41 3.1.2 Матеріал та обладнання 41 3.1.2.1 Генотипування SNP 41 II

3.1.2.2 Антитітинові антитіла Elisa 41 3.1.2.3 Радіоімуноаналіз антитіл проти AChR 42 3.1.3 Методи 42 3.1.3.1 Генотипування SNP 42 3.1.3.1.1 Суміш генотипування SNP 42 3.1.3.1.2 Такман Universal Master Mix 43 3.1.3.1.3 Полімеразна ланцюгова реакція, принцип 43 3.1.3.1.4 Генотипування, принцип 43 3.1.3.1.5 Полімеразна ланцюгова реакція, реалізація 45 3.1.3.2 Антититинове антитіло ІФА 46 3.1.3.2.1 Імуноферментний тест, принцип 46 3.1.3.2.2 ELISA для антитілових антитіл 46 3.1.3.3 Радіоімунологічний аналіз антитіл проти AChR 48 3.1.3.4 Статистичний аналіз 48 3.2 NCF1 та розсіяний склероз/малярія 49 3.2.1 Населення пацієнтів 49 3.2.2 Матеріали та обладнання 50 3.2.2.1 Виділення ДНК із цільної крові людини 50 3.2.2.2 Генотипування NCF1 50 3.2.2.3 Електрофорез у агарозному гелі 51 3.2.2.4 Поділ клітин моноцитів та гранулоцитів 51 3.2.2.5 Підрахунок та розведення поліморфно-ядерних клітин та мононуклеарних клітин периферичної крові 52 3.2. 2.6 Позначення антитіла R-фікоеритрином 52 3.2.2.7 Бредфордівський тест 53 3.2.2.8 Фарбування моноцитів та гранулоцитів антитілами до P47-фокс (D-10), міченими R-PE 53 3.2.3 Методи 53 3.2.3.1 Поділ ДНК із цільної крові людини 53 3.2. 3.2 Генотипування NCF1 54 3.2.3.2.1 Taqman Universal Master Mix 54 3.2.3.2.2 Ланцюгова реакція полімерази 55 III

3.2.3.2.3 Генотипування 55 3.2.3.3 Електрофорез у агарозному гелі 56 3.2.3.4 Поділ клітин моноцитів та гранулоцитів 56 3.2.3.4.1 Поділ клітин 56 3.2.3.4.2 Поділ моноцитів та лімфоцитів 57 3.2.3.4.3 Поділ Гранулоцити 57 3.2.3.5 Підрахунок і розведення ПМН та РВМС 58 3.2.3.6 Позначення антитіла R-фікоеритрином 58 3.2.3.6.1 p47-фокс (D-10): sc-17845 58 3.2.3.6.2 Маркування 58 3.2 .3.7 Бредфордівський тест 59 3.2.3.7.1 Принцип 59 3.2.3.7.2 Процедура 60 3.2.3.8 Фарбування моноцитів та гранулоцитів антитілами до P47-фокс (D-10), міченими R-PE, що маркуються 60 3.2.3.9 Проточна цитометрія/Сортування клітин із активованою флуоресценцією 61 3.2.3.9.1 Принцип 61 3.2.3.9.2 Проточна цитометрія 61 3.2.3.10 Статистичний аналіз 62 3.2.3.10.1 Малярія 62 3.2.3.10.2 Розсіяний склероз 62 4 Результати 63 4.1 Міастенія гравіс та PTPN22 63 4.1.1 Результати вимірювань 63 4.1.2 Частота алелів та розподіл генотипів 63 4.1.3 Частота алелів у підгрупах хворих на РС 64 4.2 NCF1 та множинних Склероз/малярія 66 4.2.1 коефіцієнти GT/GTGT та коефіцієнти MS 66 4.2.2 GT/GTGT пов'язані з субфенотипами коефіцієнтів MS 66 4.2.3 GT/GTGT та малярією 69 4.2.4 Кореляція GT/GTGT Коефіцієнт виробництва АФК у хворих на малярію 70 IV

4.2.5 Коефіцієнти GT/GTGT та концентрація гемоглобіну 70 4.2.6 Проточна цитометрія моноцитів, лімфоцитів та гранулоцитів 71 5 Обговорення 73 5.1 Міастенія гравісу та PTPN22 73 5.1.1 Вступ 73 5.1.2 Асоціація поліморфізму PTPN22 з міастенією 73 5.1.3 Асоціація поліморфізму PTPN22 з появою антитіл проти AChR та антитіла до антитіла 73 5.1.4 Антититинові антитіла та тимоми 74 5.1.5 Генотипи залежно від статусу тимоми 75 5.1.6 Аналіз підгруп пацієнтів із МГ без тимоми 75 5.1.7 Порівняння наших результатів із попередніми дослідженнями 76 5.1.8 Короткий огляд та прогноз 78 5.2 NCF1 та розсіяний склероз/малярія 79 5.2.1 Вступ 79 5.2.2 Коефіцієнти GT/GTGT у хворих на розсіяний склероз 79 5.2.3 GT/Коефіцієнти GTGT у хворих на малярію та порівняння з виробництвом АФК 80 5.2.4 Критика методу 81 5.2.4.1 Генотипування фрагментів NCF1 81 5.2.4.2 Проточна цитометрія моноцитів, лімфоцитів та гранулоцитів 82 5.2 .5 Короткий зміст та перспективи 82 6 Резюме 83 6.1 Міастенія Гравіс та PTPN22 83 6.2 NCF1 та розсіяний склероз 84 6.3 NCF1 та малярія 85 7 Бібліографія 86 Подяки 104 Автобіографія 105 V

Список скорочень 1 Список скорочень АХ = ацетилхоліну AChR = рецептора ацетилхоліну AIE = аутоімунних захворювань BSA = бичачий сироватковий альбумін CTLA4 = цитотоксичних Т-лімфоцитів антигену 4 DNS = дезоксирибонуклеїнової кислоти EAE = експериментальний аутоімунний Encephalomy = Forster = експериментальний аутоімунний Encephalomy = Фьорстера Status = Expanded Encephalomy = Фьорстера Статус Масштаб = Expanded Encephalomy = Фьорстера = Expanded Encephalomy = Forward людський лейкоцитарний антиген IVIg = внутрішньовенні імуноглобуліни KI = довірчий інтервал LYP = лімфоїдна тирозин фосфатаза MG = міастенія гравіс MGB = малий зв'язувальний жолобок MHC = основний комплекс гістосумісності MRT = магнітно-резонансна томографія MS = множинний склероз NADPH = фактор нікопінамінофосфату 1 ніспінаміду фосфату Непарні Співвідношення p47-фокс = білок47 фагоцитоксидаза РВМС = мононуклеари клітин периферичної крові PBS = фізіологічний сольовий розчин, забуференний фосфатом, ПЛР = полімеразна ланцюгова реакція фокс = окси фагоцитів ідаза ПМА = форбол-12-міристат-13-ацетат ПМН = поліморфні ядерні клітини 1

Список абревіатур PTPN22 = білок тирозинфосфатази нерецептор 22 RA = ревматоїдний артрит ROS = реактивні метаболіти кисню (реактивні форми кисню) R-PE = R-фікоеритрин SSC = побічний розкид SLE = системний червоний вовчак SNP = поліморфізм однонуклеотидного 2

Вступне та дослідницьке питання 2.2.1.8 Патогенез У MG щільність іонного каналу AChR зменшується на м’язовій торцевій пластині [Pestronk et al., 1985], а кінцева пластина руйнується. Збільшується синаптичний зазор між нервовим кінцем і постсинаптичною м’язовою мембраною [Engel et al., 1976]. Іонні канали AChR, зв’язані аутоантитілами, швидше ендоцитуються і руйнуються. Опосередковане комплементом, зв'язування антитіл призводить до руйнування постсинаптичного апарату із зменшенням постсинаптичного пальцевого апарату (див. Рис. 2). Антитіла до AChR безпосередньо блокують іонний канал AChR [Köhler et al., 2003]. Зменшена кількість відкритих іонних каналів AChR призводить до зниження потенціалу в м’язовій торцевій пластині, що вже недостатньо для створення потенціалу дії. Менша кількість активованих м’язових волокон призводить до м’язової слабкості, описаної вище. Навіть у пацієнтів із суто очними симптомами спостерігається зниження AchR на кінцевих пластинах кінцівок, що, проте, залишається субклінічним. A: здорова нервово-м’язова передача B: нервово-м’язова передача при міастенії Рис. 2: нервово-м’язова передача [від Drachman, D. B., 1994] 10

Вступ і питання дослідження 2.2.1.9 Значення тимусу У хворих на МГ тимус часто морфологічно змінений. Є тиміт з лімфофолікулярною гіперплазією, атрофією тимусу або тимомою. Однією з причин такої асоціації може бути антигенна молекулярна мімікрія: власні або екзогенні антигени, подібні до епітопів іонних каналів AChR, активують аутореактивні Т-клітини. Компоненти вірусів простого герпесу або бактеріальних інфекцій, при яких обговорюється індукція MG, можуть розглядатися як екзогенні антигени [Schwimmbeck et al., 1989]. У злоякісній тимомі спостерігається підвищена експресія нейрофіламентів, які можуть функціонувати як аутоантигенні детермінанти, оскільки вони мають AChR-подібний епітоп. Тимоми виявляються у 8,5-15% випадків у пацієнтів з МГ [Wilkins et al. 1999, Loehrer 1999, Otto 1998]. 11

Вступне та дослідницьке питання 2.2.1.10 Клінічні класифікації та оцінки 2.2.1.10.1 Класифікація за Оссерманом та Генкінсом Класифікація за Оссерманом та Генкінсом (див. Таблицю 1) була встановлена для оцінки тяжкості стану хвороби MG. Таблиця 1: Класифікація міастенії за Осерманом та Генкінсом (1971) Клас Клінічна форма Симптоми I Очна форма Птоз, диплопія IIa Легка генералізована форма Легка генералізована слабкість IIb Фаціофарингеальна форма IIa + бульбарна слабкість III Тяжка гостра генералізована форма Гостра важка генералізована слабкість, бульбарні симптоми, дихальна недостатність IV важка хронічна генералізована форма важка, часто прогресуюча генералізована слабкість 12

Початок та питання про МГ, що в основному характеризується слабкістю ротоглотки та меншою кількістю очних симптомів [Evoli et al., 2003]. 2.2.1.12 Терапія Лікування МГ базується на наступних опорах [Köhler et al., 2003]: - Введення інгібіторів ЕСТ-естерази, що покращують нервово-м’язову передачу - Імунодепресивна або імуномодулююча терапія для зниження антигенних антитіл - Комплексно спровокована запальна реакція - Інтервенційні терапевтичні заходи для лікування гострого погіршення стану, такого як міастенічний криз, наприклад терапевтичний плазмообмін за допомогою плазмаферезу або імуноадсорбції [Shibuya et al., 1994] - тимектомія 2.2.1.12.1 Інгібітори ацетилхолінестерази Інгібітори ACh естерази зв'язуються в околицях каталітичної одиниці естерази ACh і значно повільніші там у порівнянні з ACh гідролізований. Карбамільна група ковалентно переноситься на ACh естеразу і пригнічує активність ферменту на години. Запас ACh в синаптичній щілині збільшується, і ACh має більше часу, щоб зайняти місця зв'язування постсинаптичної мембрани. Найбільш поширеним діючим інгредієнтом є піридостигмін бромід (Местінон) у дозах до 300 мг/добу. 15-й

Починання та питання діагностуються, якщо тимчасово та просторово розповсюдження уражень, напр. виявляється за допомогою візуалізації (див. таблицю 2). Для діагностики РС необхідно виключити подібні клінічні картини (наприклад, колагеноз, васкуліт, бореліоз або саркоїд). РС - це коли критерії виконуються, і немає кращого пояснення клінічних симптомів. Можлива РС - це коли підозрюється, але критерії не виконуються повністю. 22-го

Вступне та дослідницьке питання FAD = флавін аденин динуклеотид Fe = заліза GDI = інгібітор дисоціації гуанозин дифосфату GDP = гуанозин дифосфат GTP = гуанозин трифосфат NADPH = нікотинамід аден динуклеотид фосфат NADPH одиниці фосфол оксид px47 оксид фосфолу p47 фосфол оксид px47 оксид фосфолу p4747 оксид фосфолу p зв’язані з мембраною одиниці gp91-фокс і р22-фокс. Для активації необхідна взаємодія між p47-фоксом та зв’язаними з мембраною одиницями. Перш за все, білок Rac повинен відокремитися від білка Rho GDI і перейти в стан, активований GTP. Тоді це може асоціюватися з плазматичною мембраною. Комплекс плазми вимагає декількох фосфорилювання, щоб він з'єднувався з мембранно зв'язаними одиницями. Активована NADPH-оксидаза продукує супероксид-аніони, які виділяються у фагоцитарні везикули або у позаклітинний простір [Heyworth et al., 2003]. Рис. 3: Активація NADPH-оксидази [від Heyworth et al. 2003] 37

Вступне та дослідницьке питання У геномі людини на ген NCF1 припадає два псевдогени (ψncf1), які на 98% ідентичні гену NCF1 і розташовані в одній області 7q11.23 на хромосомі 7 [Heyworth, Cross et al., 2003]. Розрізняють тип I ogenenncf1, який містить видалення GT на початку екзона 2, та тип II ψncf1, який не містить видалення GT [Heyworth, Noack et al., 2002]. У популяції зазвичай є два різних гаплотипи: більш поширений гаплотип з двома копіями типу I ψncf1 і однією копією NCF1 і менш поширений гаплотип з однією копією кожного типу I і типу II ψncf1 і однією копією функціонального гена [Heyworth et співавт., 2002]. Часте виникнення мутації GT при хронічному гранулематозі можна гіпотетично пояснити подіями рекомбінації між NCF1 та типом I ψncf1 (див. Рис. 4). Через їх близькість та високий ступінь подібності такі події рекомбінації можуть траплятися частіше. Тип II ψncf1, ймовірно, виникає внаслідок рекомбінації між NCF1 та типом I ψncf1. Рис. 4, модель можливого кросинговеру між NCF1 та типом I ψncf1 [від Heyworth et al., 2003] 38