Розробка індукованої етанолом моделі фіброзної печінки у даніо для вивчення родоначальника
Вступ
Незважаючи на значну регенеративну здатність гепатоцитів 1, які є основним типом паренхіматозних клітин печінки, хронічна печінкова недостатність впливає на цю здатність, що призводить до регенеруючої печінкової клітини-попередника (HPC) 2.
Хронічне ураження печінки відбувається головним чином через зловживання алкоголем, хронічний вірус гепатиту С (HCV) 3 та неалкогольну жирову хворобу печінки (NAFLD) 4. Це призводить до стійкого фіброзу печінки, який пов’язаний з накопиченням білків позаклітинного матриксу (ECM). Постійне накопичення ECM спотворює неушкоджену печінкову архітектуру, утворюючи волокнисту рубцеву тканину 5, що згодом призводить до цирозу із високою захворюваністю та смертністю. Було зроблено багато спроб послабити фібротичну реакцію, головним чином, зосередившись на пригніченні цитокінів та профіброгенних активованих міофібробластів 6. Останній отримують, головним чином, зірчасті клітини печінки (HSC) - основні непечінкові клітини паренхіми, відповідальні за формування печінкових рубців 4. Тим не менше, регенеративні терапії, що стимулюють ендогенні клітинні джерела, включаючи CAH для регенерації гепатоцитів за наявності стійких фіброгенних порушень, чекають подальшого дослідження.
Багато експериментальних моделей фіброзу печінки було описано у ссавців. Повторне введення чотирихлористого вуглецю (CCl 4) широко застосовується для індукції фіброзу печінки у мишей та щурів моделі 7. У поєднанні з дієтою з високим вмістом жиру (СН) алкоголь призводить до значного підвищення регуляції експресії профіброгенних генів та фіброзу печінки 8. Хоча стеатоз (накопичення ліпідів) виникає внаслідок гострого впливу алкоголю, він робить печінку схильною до більш серйозних уражень печінки 9.
Даніо реріо, даніо, вийшов як цінна модель хребетних для вивчення регенерації. Хоча інші нижчі хребетні, такі як тритони та аксолоти, мають надзвичайну здатність до регенерації, даніо має переваги перед іншими модельними системами щодо стратегій генетичної маніпуляції та візуалізації, необхідних для маніпулювання потенційними регенеративними факторами. 10 факторів. вивчення алкогольної хвороби печінки (ALD) шляхом простого додавання етанолу (EtOH) до їх води. Гострий вплив EtOH на личинок і дорослих даніо спричинив стеатоз печінки 11-13. Коли дорослі даніо отримували тривалий вплив EtOH, спостерігалося відкладення колагену з підвищеною регуляцією генів, пов’язаних з фіброзом 14. Однак існує потреба в розробці моделей для вивчення регенерації печінки у відповідь на EtOH як фіброгенний стимулятор.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Вирощування та виведення даніо дано за стандартним протоколом, який відповідає критеріям Національних інститутів охорони здоров’я та затверджений Комітетом інституційного догляду та використання тварин Грузинського інституту технологій.
1. Приготування розчинів
2. Підготовка личинок даніо
- Налаштуйте муфту [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 дорослий даніо з Tg (рука2: EGFP) PD24 13 дорослий даніо в шлюбних резервуарах. Використовуйте роздільники, щоб виконати спарювання за часом.
- Зніміть роздільник наступного ранку і дайте рибі спаровуватися без перерв. Збирають ембріони через 2 години, натягуючи водну систему і переносячи ембріони в чашки Петрі розміром 100 мм із зародковим середовищем.
- Зберігайте не більше 100 ембріонів на чашку Петрі. Під стереомікроскопом видаліть незапліднені яйця за допомогою скляної піпетки. Вирощують ембріони при 28 ° C і додають фенілтіосечовину (PTU) до кінцевої концентрації 0,003% через 10 годин після запліднення (HPF) для пригнічення розвитку пігменту.
3. Етанол, лікування метронідазолом та регенерація печінки у личинок даніо
4. Хімічні екрани в оброблених EtOH/MTZ личинках даніо
5. Фіксація личинок даніо, імунозабарвлення та конфокальна візуалізація
6. Підготовка дорослих даніо
- Налаштуйте муфту [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15.17 Дорослі даніо в шлюбних резервуарах. Збирають ембріони наступного ранку, витісняючи воду з системи і переносячи ембріони в чашки Петрі розміром 100 мм із зародком середовища.
- Зберігайте не більше 100 ембріонів на чашку Петрі. Під стереомікроскопом видаліть незапліднені яйця за допомогою скляної піпетки. Вирощують ембріони при 28 ° C і додають PTU до кінцевої концентрації 0,003% через 10 HPF, щоб пригнітити розвиток пігменту.
- При 4 dpf використовуйте трикаїн для знеболення личинок та сортування їх [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] личинки. Промийте трикаїн, кілька разів змінивши свіжий ембріон. Дайте личинкам відновитися при 28 ° C, поки вони не досягнуть нормального пульсу 120-180 ударів в хвилину 18.
- Підніміть відсортовані личинки протягом 6-12 місяців за стандартною процедурою 19.
7. Етанол, лікування метронідазолом та регенерація печінки у дорослих даніо
8. Фіксація печінки дорослих даніо, імунофарбування та конфокальна візуалізація
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Подяка
Ця робота була частково підтримана грантами від GTEC (2731336 та 1411318), NIH (K01DK081351) та NSF (1.354.837) до CHS. Ми дякуємо Алему Джорджісу за критичне прочитання рукопису.