Синергетичне використання нервових клітин-попередників та самозбірних пептидів в експериментальній шийці матки

Анотація

Вступ

Більше 50% пошкоджень спинного мозку шийного відділу хребта. У клініці описані два основні патофізіологічні механізми: початковий забій спинного мозку і згодом триваючі компресійні переломи кісток, кровотеча або набряк тканин, викликані.

Модель затискання/компресії аневризми імітує обидва патофізіологічні механізми: клацання затиску створює защемлення, а тривалість відсікання забезпечує компресійний компонент, завдяки якому компресія в клінічних умовах, спричинена переломами кісток, кровотечею або набряком тканин, триває значно довше. Використовуваний затиск для аневризми змінюється кільцевою пружиною, що гарантує точну та відтворювану силу відсікання. Зокрема, у порівнянні з моделлю гемі-трансекції або контузії, ця модель кліпси для аневризми імітує найкращі клінічні умови. У той час як пацієнти з травмами грудної клітки страждають параплегією, більшість пацієнтів з травмами шийки матки є квадриплегічними та повністю залежними. Однак анатомічна будова шийного мозку значно відрізняється порівняно з грудним або поперековим відділом хребта, і, отже, конкретний протокол.

Розвиток медулярних порожнин та рубцювання тканин є перешкодами для відновлення та регенерації. Для подолання цих перешкод використанням будівельних лісів є перспективним підходом. Самозбірні пептиди можна вводити безпосередньо в епіцентр ураження. Там вони зібрані в нановолокнисті риштування, що з’єднують порожнину та покращують інгібуюче середовище, зменшуючи запалення та страх тканин. Хоча жорсткі матеріали завдають значного пошкодження спинному мозку під час імплантації, рідинні пептиди можна вводити безпечно і без серйозних додаткових пошкоджень.

Поліпшення інгібуючого середовища за допомогою самоорганізуючих пептидів до трансплантації стовбурових клітин, отже, підтримує інтеграцію клітин, їх диференціацію та в кінцевому рахунку функціональне відновлення після пошкодження шийного відділу спинного мозку.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

ПРИМІТКА: Наступний експериментальний протокол був затверджений Комітетом з догляду за тваринами Університетської мережі охорони здоров’я (Торонто, Канада) і створений відповідно до керівних принципів в Інструкції з догляду та використання експериментальних тварин, підготовленої Канадською радою по догляду за тваринами. .

1. Модель контузії/компресії затиску аневризми шийки матки

2. Ін’єкція SAP і NPC (14 днів після травми)

90% живих клітин у клітинній суспензії. Розведіть клітини в ростовому середовищі (50 х 103 живих клітин/мкл) і використовуйте їх для трансплантації клітин.

  • Зробіть чотири внутрішньоспінних ін’єкції по 2 мкл (8 мкл загального обсягу, з 4 х 10 5 НПК) двосторонніми ін’єкціями на ростральній та каудальній ділянках 2 мм до місця пошкодження. Відкривши тверду мозкову оболонку, помістіть мікроскляний капіляр Гамільтона на 1,5 мм нижче тильної поверхні спинного мозку та введіть 2 мкл суспензії клітин. Виберіть швидкість ін'єкції близько 0,5 мл/хв (хв).
  • В кінці кожної ін'єкції та перед тим, як витягувати капіляр з кабелю, зачекайте принаймні 1 хв, щоб тканина розтягнулася, щоб розмістити новий об'єм клітини. (Малюнок 2)

    • 3. Імплантація субдуральних насосів для застосування фактора росту

    1. Пожертвуйте тваринами в кінці періоду спостереження (наприклад, через 4 тижні після ДЗЗ) під глибокою анестезією (5% ізофлуран протягом 2-3 хв) і перфузуйте їх транскардально 50 мл холодного (4 ° С) сольового розчину, а потім 150 мл холодного 4% Параформальдегід в 0,1 М сольовому розчині, забуференному фосфатом (PBS).
    2. Видаліть спинний мозок і замочіть його у 4% параформальдегіді в 0,1 М сольовому розчині, забуференному фосфатом (PBS), на 24 години.
    3. Помістіть спинний мозок у 25% розчин сахарози для кріоконсервації на 48 годин.
    4. Надайте поздовжні кріосекції товщиною необхідної передплати. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Виконуючи вищезазначену процедуру, риштування SAP перекриває порожнину і забезпечує поліпшення інгібуючого середовища, менше рубцювання тканин і збільшення виживання NPC, Рис.4 показано поздовжній розріз спинного мозку щура на місці пошкодження, отриманий через 6 тижнів після ІСМ та через 4 тижні після ін'єкції QL6 SAP та трансплантації NPC. Пептиди QL6 успішно вводили в кістковий мозок, агрегували їх в епіцентрі та дифузно ростро-каудально в півтіні. Зображення з електронним мікроскопом далі показано в Малюнок 5, де розташування 1% (мас./об.) пептидів QL6 на нановолоконному помості розбавляється в розчинах PBS протягом 2 год.

    Ця матриця забезпечує поліпшення інгібуючого середовища за рахунок збільшення виживання та диференціації клітин, зменшення рубцевих тканин і, зрештою, призводить до кращих можливостей функціонального відновлення.

    ure 1 "src ="/files/ftp_upload/52.105/52105fig1highres.jpg "/>Рисунок 1: Модель аневризми контузії/стиснення кліпів (A) Фотографія за допомогою хірургічного мікроскопа після ламінектомії C7/T1 та контузія кліпа/компресія спинного мозку щура (B) Гарантуйте зображення затискача з кільцевою пружиною точний. Замикаюча сила.

    синергетичне
    Рисунок 2: Точки ін’єкції САП та стовбурових клітин Графічне зображення Точки впорскування:. 2 ін’єкції стереотактичним шляхом SAP в епіцентр ураження, після чого 4 ін’єкції NPC у сусідні спинні колони на відстані 2 мм каудально і рострально від епіцентру.

    використання

    3: Субдуральний катетер для введення фактора росту Фотографія за допомогою хірургічного мікроскопа: (A) Імплантовані субдуральні катетери для доставки факторів росту. катетер кріпиться кількома швами 6,0, коли прикріплені параспінальні м’язи; невеликий отвір твердої мозкової оболонки при С5; Субдуральне позиціонування катетера з відкритим кінцем катетера поблизу вогнища ураження при C7/T1. (B) Катетер підключений до мікронасоса в субдуральному поглибленні, прикріпленому до бічної борти.

    самозбірних
    Малюнок 4: Успішна доставка SAP та NPC до шийного мозку Флуоресцентне фарбування (фон DAPI, синій) для поздовжнього зрізу травмованого спинного мозку щур. Помічені SAP (QL6-FITC, зелений) накопичилися в епіцентрі ураження. Ін'єктовані NPC (DsRed позитивний, червоний) знаходяться в дифузному рустальному та каудальному напрямках. Смуга шкали позначає 5 мм.

    пептидів
    Рис. 5: Формування каркасу нановолокон Зображення із скануючим електронним мікроскопом (SEM) демонструє нановолоконні риштування встановлених SAP. Шкала шкали відноситься до 1 мкм).

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Цей протокол був розроблений, щоб дозволити читачеві виконати модель пошкодження шиї на щурах та застосувати комбінований підхід до лікування з SAP та NPC, що сприяє кращому одужанню після СНІ на шиї.

    Особливо, якщо порівнювати з іншими моделями пошкодження шийного відділу хребта, такими як модель (гемі) -трансекції або моделі схуднення та струсу, модель защемлення/стиснення затиску представляє два основні патофізіологічні механізми травми - синці та тиск - і, отже, імітує найкращі клінічні Умови. Незважаючи на те, що він нещодавно був призначений для використання у щурів та мишей BWS 7-11, він підходить для використання в шийному відділі хребта. Це був важливий крок, оскільки травми шийного відділу спинного мозку найчастіше спостерігаються в клініці, а анатомія шийки матки значно відрізняється від анатомії грудного відділу хребта. Крім того, пацієнти з ТНС на шиї з тетрапарезом прагнуть хоча б частково відновити рухове помазання верхніх кінцівок.

    Самозбірні пептиди були визначені з потенціалом для сполучення порожнини, а також для поліпшення інгібуючого середовища в місці ураження, що в кінцевому підсумку навіть призвело до регенерації аксонів і проростання 5, 12, 13, 14. Нановолокна QL-6 збираються, щоб створити риштування, що сполучають медулярну порожнину, і таким чином можуть забезпечити матрицю для проростання та регенерації аксонів та поліпшення інгібуючого середовища до трансплантації клітин. Переваги цих пептидів полягають у їх низькій в'язкості (рідини) та нейтральному рН. Зокрема, порівняно з високовязкими гідрогелями або тканинними лісками, SAP можна легко вводити в пошкоджений спинний мозок, і подальші травми, отримані в результаті самої ін'єкції, обмежені.

    Хоча самі нановолокна QL6 можуть покращити виживання клітин 4,15, проте використання факторів росту виявляється корисним для 16,17,18,19,20,21. Їх можна вводити або за допомогою факторів росту 22 без гідрогелів, або за допомогою осмотичних насосів (як описано вище). Осмотичні насоси, підключені до субдуральних катетерів, мають перевагу безперервного та контрольованого вивільнення і, отже, збагачення шийної спинномозкової рідини (СМЖ). Влаштування субдурального катетера, однак, є складним завданням, особливо щодо великих рубців, які виникли через кілька тижнів після травми.

    Щоб створити хороші тканинні умови для виживання та інтеграції NPC, кілька досліджень відібрали точки ін’єкції в сусідній білій речовині, рострально або каудально на 2 мм до ураження, а не безпосередньо в епіцентрі ураження 4,15,18. Там NPC мають більше шансів на виживання, інтеграцію та диференціацію в астроцити, олігодендроцити та нейрони, і можуть мігрувати до або в область ураження, що призводить до проростання аксонів та покращення аксонального зв’язку.

    Після освоєння цих методів цей запропонований протокол може бути прийнятий індивідуальним користувачем відповідно до його потреб та інтересів, змін рівня та тяжкості пошкодження, використання різних типів клітин або факторів росту або спільно з іншими нервово-захисними речовинами .

    У рубці порожнеч і тканин: Таким чином, комбіноване лікування за допомогою SAP і NPC може запропонувати новий та перспективний підхід до подолання найскладніших перешкод при лікуванні ІМС.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Подяка

    Ми хотіли б визнати підтримку цієї роботи з боку Канадських інститутів досліджень охорони здоров’я (CIHR), Фонду сім’ї Крембілів, кафедри Халберта з нейронного ремонту та регенерації, Філіпа та Пеггі Дезвірек та Гордона Яо за внесок у Клаус Цвекбергер був підтриманий грантом "Deutsche Forschungsgesellschaft" (DFG).