Синево Молдова С-генотипуючий вірус гепатиту
Загальна інформація та рекомендації
Як і інші РНК-віруси, ВГС має на рівні нуклеотидів значне генетичне різноманіття, породжене високою швидкістю мутацій вірусу. Для того, щоб певним чином структурувати це генетичне різноманіття, на основі філогенетичного аналізу геномної послідовності було сформульовано класифікацію HCV у 6 генотипах (звані 1, 2, 3, 4, 5, 6). Кожен генотип, у свою чергу, філогенетично підрозділяється на один або кілька підтипів (звані a, b, c тощо). Ці назви стали стандартною системою для нової номенклатури генотипів ВГС 10; 11. Крім того, заражені ВГС люди циркулюють і поводяться як суміш різних вірусних популяцій, які називаються квазівидами.
6 основних генетичних типів відрізняються один від одного послідовностями нуклеотидів у пропорції 30-35%; між підтипами існує різниця 20-25%, а в межах того ж підтипу різниця до 10%.
Геном HCV складається з доменів, які сильно відрізняються за швидкістю мутацій та мінливістю послідовностей нуклеотидів. Таким чином, неперекладена область на 5 'кінці генома (5'UTR) являє собою найкраще збережений домен із найменшою швидкістю еволюції. Потім слідує ген С (серцевина), який кодує ядро нуклеокапсиду білка і який еволюціонує втричі швидше порівняно з 5'UTR-областю. Гени, що кодують білки оболонки E1 та E2, складають гіперваріабельну область, яка відрізняється від одного ізоляту до іншого. Це дозволяє вірусу обходити імунні механізми господаря, спрямовані проти доступних білків у оболонці вірусу.
Генотипи та підтипи ВГС представляють складні закономірності географічного розподілу, відносної поширеності та способів передачі інфекції, які можна краще зрозуміти, якщо їх класифікувати на три групи:
1. Епідемічна група включає підтипи 1a, 1b, 2a, 2b та 3a, які мають загальне поширення та відповідають за більшість інфекцій у всьому світі. Швидке глобальне поширення цих підтипів є результатом їх ефективної передачі через інфіковані препарати крові та введення внутрішньовенних препаратів. Підтипи 1b та 2a переважно пов'язані з передачею через продукти крові, і їх відносна поширеність зменшилася за останні роки завдяки покращеному скринінгу донорів. Підтипи 1а та 3а зустрічаються переважно у наркоманів, і їх поширеність зростає.
2. ендемічна група має менший розподіл, ніж епідемічна група, обмежена певними регіонами. Наприклад, підтипи генотипу 6 зустрічаються лише в Південно-Східній Азії. Дуже високе генетичне різноманіття ендемічних штамів свідчить про тривалу стійкість інфекції в цих регіонах через підтримку відносно неефективних способів передачі, включаючи статеві.
3. Місцева епідемічна група має високу поширеність у певних регіонах та популяціях земної кулі. Таким чином, підтип 4а відповідає за зараження понад 10% населення Єгипту і рідко зустрічається за межами Близького Сходу. Епідеміологічні дослідження дозволяють припустити, що це явище відбулося у ХХ столітті, під час масового внутрішньовенного введення ліків проти шистосомозу 11 .
У нашій країні переважають генотип 1b та суміш генотипів 1a та 1b 4. Недавнє дослідження, проведене в Інституті Матея Балса в Бухаресті на 670 пацієнтах, показало 99,7% поширеність генотипу ВГС 16 .
Знання генотипу вірусу забезпечує прогностичну інформацію щодо ефективності терапії у хворих на хронічний вірусний гепатит HCV. Наприклад, генотип 1b (найчастіше набутий після трансфузії) асоціюється з поганою реакцією на лікування та підвищеним ризиком цирозу та гепатоцелюлярної карциноми. З іншого боку, генотипи 2 і 3 (придбані переважно внаслідок вживання наркотиків внутрішньовенно) пов’язані зі сприятливою реакцією на противірусну терапію 7; 8; 9 .
Національний інститут охорони здоров’я США (NIH) показав у 2002 р., Що визначення генотипів ВГС є важливим при виборі оптимальних доз інтерферону та рибавірину, а також тривалості лікування. Таким чином, для пацієнтів з генотипом 1 дикого типу рекомендується тривалість лікування 48 тижнів, а для пацієнтів з генотипом 2 та 3 тривалістю 24 тижні з меншими дозами рибавірину. Для генотипування ВГС корисно проводити всі інфекції вірусу С перед початком будь-якого лікування 1 .
Тест, проведений у нашій лабораторії, використовує метод ПЛР для ампліфікації деяких областей геному ВГС з подальшою зворотною гібридизацією для виявлення генотипів ВГС 1-6 та підтипів а і b генотипу 1 5 .
Регіон 5'UTR представляє безліч послідовностей, специфічних для кожного генотипу, розподілених уздовж 7 малих змінних областей, які можуть дати точну інформацію про генотипи 1-5 та підтипи а і b генотипу 6. Через велику послідовну подібність субкліпи cl генотипу 6 ( раніше класифіковані як 7, 8, 9 та 11) неможливо відрізнити від генотипу 1 лише аналізуючи область 5'UTR. Точність ідентифікації підтипів 1a та 1b шляхом аналізу області 5'UTR становить від 80% до 95% і залежить від конкретних тестованих ізолятів 3. Наш тест використовує послідовності області ядра у поєднанні з областю 5'UTR для ідентифікації підтипів генотипу 6, c-1. Для підвищення точності ідентифікації підтипів 1a та 1b включені додаткові послідовності генних ядер. .
Навчання пацієнта - не потрібна спеціальна підготовка 5 .
Зібраний зразок - кров прийде 5 .
Збиральний контейнер - пилосос, що містить ЕДТА як антикоагулянт 5 .
Кількість зібраного - стільки, скільки дозволяє вакуум 5 .
Причини відхилення спробувати - використання гепарину як антикоагулянта; коагульовані або гемолізовані зразки 5 .
Перевірка стійкості - Кров ЕДТА стабільна 48 годин при 2-8ºC 5 .
Метод - ланцюгова реакція полімеризації з наступною зворотною гібридизацією; продукт біотинільованої ампліфікації проходить процес гібридизації з використанням олігонуклеотидних зондів, специфічних для 5'UTR та основних областей різних генотипів ВГС, прикріплених до нітроцелюлозній смузі; після етапу гібридизації додають кон’югат (мічений лужною фосфатазою стрептавідин), який приєднується до біотинільованого гібриду; доданий хромогенний субстрат врешті-решт вступить у реакцію з лужним комплексом стрепатвідин-фосфатази і утворить коричнево-фіолетовий осад, який буде візуалізований у вигляді смужок; інтерпретація результатів здійснюється за допомогою картки 5 .
Межі та перешкоди
Генотипування ВГС не рекомендується проводити для скринінгу або підтвердження ВГС-інфекції. Тест можливий лише у разі вірусу C> 600 МО/мл.
У деяких випадках можуть бути отримані незрозумілі результати через неоднорідність послідовностей геному ВГС, змішані інфекції або (рідкісне) існування рекомбінантних штамів ВГС 5 .
1. Практичні рекомендації AASLD http: /www.aasld.org/pdffiles/Prac._Guide_Hep_C
2. Консенсусна конференція Лікування гепатиту C. Maison de la Chimie, Париж, Франція, 27 - 28 лютого 2002 р. Agence Nationale d ”Accreditation et d” Evaluation en Sante (ANAES).
3. Chen Z, Weck KE. Генотипування вірусу гепатиту С: опитування 5 ’неперекладеної області не може точно відрізнити генотипи 1а та 1b. У J Clin Microbiol. 2002; 40: 3127-3344.
4. Ілеана Константинеску, Клінічний інститут Фундені. Генотипування вірусів гепатиту в Румунії. Симпозіум червень 2008 р., Tg. Муреш: Роль методів молекулярної біології у з'ясуванні механізмів зараження вірусом гепатиту С, а також у відкритті нових маркерів фіброзу та гепатоцелюлярної карциноми, пов'язаних з цією інфекцією.
. 5. Синевська лабораторія. Конкретні посилання на використовувану технологію роботи. 2009. Тип посилання: Каталог.
6. Неага Еміль. Поширеність генотипу 1 ВГС у Румунії. Симпозіум, червень 2008 р., Tg. Муреш: Роль методів молекулярної біології у з'ясуванні механізмів зараження вірусом гепатиту С, а також у відкритті нових маркерів фіброзу та гепатоцелюлярної карциноми, пов'язаних з цією інфекцією.
7. Нгуєн М.Х., Кіф Е.Б. Поширеність та лікування генотипів вірусів гепатиту С 4,5 та 6. У Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 рік; 10: S97 - S101.
8. Павлоцький Я.М. Генетична мінливість вірусу гепатиту С: патогенні та клінічні наслідки. В Clin Liver Dis. 2003; 7; 45 - 66.
9. Seeff LB, Hoofnagle JH Додаток: Конференція з питань розвитку консенсусу Національного інституту охорони здоров’я: Управління гепатитом C 2002. In Clin Liver Dis. 2003; 7: 261-287.
10. Simmonds P, Bukh J, Combet C et al. Консенсусні пропозиції щодо єдиної системи номенклатури генотипів вірусу гепатиту С. У Гепатолі. 2005 рік; 42; 962 - 973.