ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ Мюнхена - PDF Завантажити безкоштовно

Клініка та поліклініка травматологічної хірургії Клінікум рец дер Ізар TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Миша MDR 2 як модель остеодистрофії печінки Андреа Шмід Повна копія дисертації, затвердженої Медичним факультетом Мюнхенського технічного університету для здобуття наукового ступеня доктора медицини Голова: ун-т-проф. Лікар. Е. Дж. Руммени Експерт дисертації: 1. ап. А. К. Нюсслер, Тюбінгенський університет імені Еберхарда-Карла 2. Університет-проф. Лікар. Р. фон Айзенхарт-Роте Дисертація була подана до Мюнхенського технічного університету 31 липня 2012 року та прийнята Медичним факультетом 13 листопада 2013 року.

університет

Зміст Зміст Список скорочень 1 Вступ 1 1.1 Загальний вступ 1 1.2 Печінка 1 1.2.1 Гістологічна будова печінки 1 1.2.2 Фізіологічні функції печінки 2 1.2.3 Патофізіологія печінки 3 1.3 Кістки 4 1.3.1 Будова кісток, будова кісток і клітини 4 1.3.2 Моделювання та фізіологічні функції кістки 5 1.3.3 Дисбаланс кісткового метаболізму 6 1.4 Ситуація дослідження 7 1.4.1 Зміни кісток при хронічних захворюваннях печінки 7 1.4.2 Оборотність печінкової остеодистрофії 8 1.5 Метаболізм вітаміну D 10 1.6 Роль TGF-β у печінці метаболізм та кістковий метаболізм 11 1.7 Альтернативна модель тварин 13 1.8 Питання для дослідження 14 2 Матеріал та методи 15 2.1 Дизайн дослідження 15 2.2 Випробувані тварини 16 2.2.1 Штами мишей 16 2.2.2 Підготовка препарату 17

Зміст 2.2.2.1 Матеріал 17 2.2.2.2 Метод 17 2.3 Гістологія 18 2.3.1 Гістотехнологія 18 2.3.1.1 Фіксація зразків тканини печінки 18 2.3.1.1.1 Матеріал 18 2.3.1.1.2 Принцип 18 2.3.1.1.3 Виконання фіксації тканини 18 2.3 .1.2 Дегідратація та впровадження зразків тканини печінки 18 2.3.1.2.1 Матеріал та обладнання 18 2.3.1.2.2 Принцип дегідратації та закладення 19 2.3.1.2.3 Проведення дегідратації та закладення 19 2.3.1.3 Виробництво парафінових секцій 19 2.3. 1.3.1 Матеріал та обладнання 19 2.3.1.3.2 Принцип підготовки розділів 20 2.3.1.3.3 Процедура 20 2.3.1.4 Фарбування та встановлення гематоксилін-еозину 20 2.3.1.4.1 Матеріал 20 2.3.1.4.2 Принцип дії гематоксиліну Фарбування еозином 21 2.3.1.4.3 Проведення фарбування 21 2.3.1.5 Фарбування та кріплення трихромом Masson-Goldner 23 2.3.1.5.1 Матеріал та обладнання 23 2.3.1.5.2 Принцип фарбування трихромом Masson-Goldner 24 2.3. 1.5.3 Проведення фарбування 24 2.3.2 Мікроскопічна оцінка зрізів печінки Підготовка 27 2.3.2.1 Пристрої та програмне забезпечення 27 2.3.2.2 Принцип світлової мікроскопічної оцінки 27

Зміст 2.3.2.3 Проведення світлової мікроскопічної оцінки 27 2.4 Визначення та оцінка значень сироватки крові 28 2.4.1 Визначення активності ферменту 28 2.4.1.1 Матеріал, обладнання та програмне забезпечення 28 2.4.1.2 Принцип визначення активності ферменту 29 2.4.1.3 Проведення визначення активності ферменту 29 2.4.2 TGF-β -Визначення концентрації 31 2.4.2.1 Матеріали, пристрої та програмне забезпечення 31 2.4.2.2 Принцип 32 2.4.2.3 Виконання визначення концентрації TGF-β 32 2.5 Вимірювання мікро-КТ 35 2.5.1 Пристрій та програмне забезпечення 35 2.5.2 Принцип вимірювання µct ​​35 2.5 .3 Проведення вимірювання µct ​​35 2.5.4 Описані кісткові параметри 36 2.6 Кількісна оцінка експресії генів у печінці та кістковій тканині 36 2.6.1 Виділення РНК із печінки та кісткової тканини 36 2.6.1.1 Матеріал, обладнання та програмне забезпечення 36 2.6.1.2 Принцип РНК Виділення 37 2.6.1.3 Виконання виділення РНК 38 2.6.2 Додатковий синтез ДНК (кДНК) 40 2.6.2.1 Матеріал та обладнання 40 2.6.2.2 Принцип синтезу кДНК 40 2.6.2.3 Виконання г синтезу кДНК 41 2.6.3 Ампліфікація кДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та електрофоретичного розділення ДНК 41 2.6.3.1 матеріал, обладнання та програмне забезпечення 41

Зміст 2.6.3.2 Принцип ПЛР та гель-електрофорезу 42 2.6.3.3 Проведення ПЛР та гель-електрофорезу 43 2.6.3.4 Застосовані праймери 44 2.6.4 Денситометрична оцінка експресії генів 46 2.6.4.1 Програмне забезпечення 46 2.6.4.2 Принцип та виконання денситометричної оцінки 46 2.7 Статистика Оцінка 46 2.7.1 Програмне забезпечення 46 2.7.2 Виконання статистичної оцінки 46 3 Результати 47 3.1 Гістологічна оцінка тканини печінки з часом 47 3.2 Підвищення рівня трансаміназ та дегідрогенази в сироватці крові мишей MDR2 -/- 51 3.2.1 Активність ферменту LDH 51 3.2. 2 Ферментна активність ASAT 52 3.2.3 Ферментна активність ALAT 53 3.3 Змінена архітектура кістки у мишей MDR2 -/- 54 3.3.1 Архітектура кіркової кістки 54 3.3.2 Архітектура кісткової залози 56 3.4 Хронічно підвищений рівень TGF-β в сироватці крові у мишей MDR2 -/- 60 3.5 Знижена експресія кісткових маркерів у старші миші MDR2 -/- 61 3.5.1 Експресія OPN в тканині печінки 62 3.5.2 Експресія остеокальцину в тканині печінки 63 3.5.3 Експресія OPG в тканині печінки 64 3.5.4 Експресія OPN в кістковій тканині 65 3.5.5 Експресія остеокальцину в кістковій тканині 66

Зміст 3.6 Експресія генів у тканині печінки ферментів, що регулюють метаболізм вітаміну D, 67 4 Обговорення 69 4.1 Обмеження та перспективи 77 5 Короткий зміст 80 6 Список малюнків 82 7 Список таблиць 83 8 Бібліографія 84 9 Додаток 94 9.1 Оптимізація фарбування 94 9.1.1 Фарбування ВІН 94 9.1.2 MGT Фарбування 95 9.2 Додаткові гістологічні зображення 96 9.3 Додаткова інформація про використовувані праймери 98 9.3.1 β-актин 98 9.3.2 Остеокальцин 100 9.3.3 Остеопонтин 105 9.3.4 Остеопротегерин 107 9.3.5 MDR2 111 10 Подяки 117

Список скорочень 25 (OH) D 3 25-гідроксихолекальциферол 1,25 (OH) 2 D 3 1α, 25-дигідроксихолекальціферол PBC PBS PCR ph PSC PTH RANKL RNA RT RT-PCR sec SMI Taq TBE Tb.N Tb.Sp Tb.Th TGF -β TRAP TV ao UV V VDBP напр. первинний біліарний цироз фосфатно-сольовий розчин полімеразна ланцюгова реакція pondus hydrogenii первинний склерозуючий холангіт паратиреоїдний гормональний активатор рецептора для ядерного фактора κ B ліга рибонуклеїнова кислота кімнатна температура зворотна транскриптаза полімеразна ланцюгова реакція друга Структурна модель індекс включаючи, наприклад, ультрафіолетові вольти, що зв’язують вітамін D білок

1 Вступ 13 Рис. 1-5 Гіпотетичний механізм регуляції печінкової остеодистрофії TGF-β як можливий регулятор Графічні джерела: http://www.servier.de/medicalart/skelett-und-knochen/?catselect=5; http://www.servier.de/medicalart/ arterien -ziologische /? catselect = 0; http://www.servier.de/medicalart/verdauungssystem/?catselect=7; 5 серпня 2011 р. 1.7 Альтернативна тваринна модель В цілому не існує точно проведених довготривалих досліджень in vivo на предмет печінкової остеопатії. У такому випадку популяція пацієнтів (тип, тривалість, стадія захворювання печінки; вік, стать, супутні захворювання

2 Матеріал та методи 22 1. Деекстрація Roticlear I 3 хв Roticlear II Roticlear III 2 хв 2 хв Roticlear IV 2 хв Roticlear V 2 хв 2. Регідратація 99,9% EtOH I 3 хв 99,9% EtOH II 3 хв 99,9 % EtOH III 2 хв. 90% EtOH 2 хв. 80% EtOH 2 хв., Тобто 2 O 2 хв. 3-е фарбування розчину гемалю кислим згідно з Mayer 5 хв. Проточною водопровідною водою 15 хв. Розчин еозину G 0,5% водний 3 хв., Тобто 2 O короткий 4. Дегідратація 80% EtOH 30 сек. 90% EtOH I 4 хв. 90% EtOH II 4 хв. 99,9% EtOH I 3 хв. 99,9% EtOH II 5 хв. 5. Прозорий Roticlear I 3 хв. Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 хв 5 хв 5 хв 3 хв. Таблиця 2-2 Протокол фарбування гематоксилін-еозином сек: секунда Результати фарбування - ядра клітин синьо-фіолетового кольору, блідо-червона цитоплазма, червоні м’язові волокна, червоно-оранжеві еритроцити та червона колагенова сполучна тканина (див. рис. 2-1 ).

2 Матеріал та методи 23 Рис. 2-1 Приклад фарбування еозином гематоксиліну печінки, самки MDR2 -/- миші, тиждень життя 5 2.3.1.5 Трихромне фарбування та кріплення Masson-Goldner 2.3.1.5.1 Матеріал та обладнання Ротипуран 100% оцтова кислота (Cat-No.: 3738.4) EtOH 99,9%, 90%, 80%, 70% Розчин гематоксиліну A згідно Weigert Гематоксиліновий розчин B згідно Weigert Apotheke des MRI ROTH (Cat-No: X906.1) ROTH (Cat. No.: X907.1) Світло-зелений SF жовтуватий МЕРК (Кат. No: 115941) Помаранчевий G МЕРК (Кат. №: 115925) Poncau Xylidine FLUKA Chemie GmbH (Кат. №: 81465) Кислий фуксин FLUKA Chemie GmbH (Кат.: 84600) Гідрат тунгстофосфорної кислоти, кристалічний найчистіший МЕРК (Cat-номер: 100582) Roticlear ROTH (Cat-No: A538) Діапазон магнітних паличок Магнітна мішалка MR Hei-Mix L Аналітичні ваги ROTH (Cat-No: C267.1) Heidolph Instruments, D-Schwabach Kern and Son GmbH, D-Balingen

2 Матеріал та методи 25 3. Кислота фуксину понсо ксилідини 0,2 г (г) ксилідини Понсо 0,1 г кислота фуксин 300 мл ддг 2 O 0,6 мл 1% оцтова кислота 4. Фосфотуфрамова кислота помаранчева G 12 г вольфтофосфорна кислота 3 г помаранча G 200 мл ddh 2 O 5. світло-зелений 0,3 g світло-зелений SF жовтуватий 200 ml ddh 2 O 0,4 мл 1% оцтова кислота Згадане фарбування проводили згідно з протоколом, розробленим шляхом оптимізації кольору (див. Розділ 9.1 нижче) (див. Таблицю 2-3) . Потім забруднені, осушені та очищені ділянки покривали Roti -Histokitt II таким же чином, як і фарбовані секції HE. Суміш гематоксиліну А і В за Вейгертом можна витримувати максимум 8 днів при кімнатній температурі. Результатами фарбування є чорно-коричневі ядра клітин, червона цитоплазма, світло-червоні м’язові волокна, оранжево-червоні еритроцити та зелена колагенова сполучна тканина (див. Рис. 2-2). Рис. 2-2 Приклад забарвлення печінки трихромом Массона-Голднера, самки MDR2 -/- миші, вік 44 тижні

2 Матеріал і методи 26 1. Деекстрація Roticlear I 3 хв Roticlear II Roticlear III 2 хв 2 хв Roticlear IV 2 хв Roticlear V 2 хв 2. Регідратація 99,9% EtOH I 3 хв 99,9% EtOH II 3 хв 99,9 % EtOH III 2 хв. 90% EtOH 2 хв. 80% EtOH 2 хв. 3-е фарбування гематоксиліном за Вейгертом 4 хв. Проточною водопровідною водою 10 хв. Кислота фуксин-Понсо-ксилідини 2-4 хв. Світло-зелений 15 хв. 1% оцтової кислоти 2 хв. 4. Дегідратація 80% EtOH 30 с. 90% EtOH I 4 хв. 90% EtOH II 4 хв. 99,9% EtOH I 3 хв. 99,9% EtOH II 5 хв. 5. Прозорий Roticlear I 3 хв Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 хв 5 хв 5 хв 3 хв Таблиця 2-3 Протокол трихромного фарбування Массона-Голднера

2 Матеріали та методи 28 Гематоксилін-еозин Массон-Голднер Tri. I стадія плюс 0 LRMCLRMC перидуктальні сполучнотканинні відкладення 1-3 набряк 1 портальний запальний інфільтрат 1 стадія II плюс 5 проліферація жовчних проток 1 перипортальний запальний інфільтрат 1 портально-перипортальний фіброз 1-5 мокроїдний некроз 1 стадія III плюс 13 атрофія жовчних проток 1 некроз грудної кори 1 -3 IV плюс 18 розрідження жовчних проток 1 жовчний цироз 1 результат Таблиця 2-4 Оцінка для гістологічної оцінки 2.4 Визначення та оцінка значень сироватки крові 2.4.1 Визначення активності ферментів 2.4.1.1 Матеріал, прилади та програмне забезпечення Набір для тестування Fluitest LDH-L ANALYTICON Biotechnologies (Cat. No: 2222 ) Біотехнології Fluitest GOT/ASAT ANALYTICON (Кат. №: 1176) Біотехнології Fluitest GPT/ALAT ANALYTICON (Кат. №: 1186) LDH-Стандарт 0: Мульти Нобіс Калсерум/НІТАДО

де/хв 2 Матеріал і методи 31 зміна поглинання, що утворюється за хв. Ці середні значення були побудовані на точковій діаграмі на ординаті проти відомих активностей ферментів за стандартом на абсцисі. Потім була розрахована лінійна найкраща лінія точкової діаграми, а також функція, що описує її, та її коефіцієнт детермінації. Виміряне значення для стандарту 8 відповідало порожньому значенню. Розрахована функція була доступною у такій формі: Після розв’язання формули для x для y використовували проміжок часу від 0 хв до х хв кожної зразки сироватки. Визначені таким чином значення х відповідали ферментативній активності зразка сироватки, скоригованої на значення порожньої величини, і були перенесені в таблиці Microsoft Excel, статистично оцінені за допомогою GraphPad Prism та відображені графічно. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0,05,05 Стандартна крива LDH y = ​​0,0027x - 0,0213 R² = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120140 Активність ферменту [U/л] Рис. 2-3 Приклад стандартної кривої Фотометрична оцінка LDH стандартних розчинів LDH, включаючи стандарти 3-7 2.4.2 Визначення концентрації TGF-β 2.4.2.1 Матеріал, обладнання та програмне забезпечення Рекомбінантний людський TGF-β 1 peprotech ( Номер за каталогом: 100-21) Dulbecco s PBS (1) PAA Laboratories GmbH (номер за каталогом: H15-002)

de/min 2 Матеріал і методи 34 Призначення збільшення вимирання за хвилину конкретній концентрації TGF-β було зроблено за допомогою стандартної кривої (див. рис. 2-4). Для цього середні значення першого стандарту щодо відомих концентрацій TGF-β 1 на стандарт наносили на абсцису в точковій діаграмі на ординаті. Розраховували лінію лінійної регресії точкової діаграми, а також функцію, що її описує, та її коефіцієнт детермінації, із значенням, виміряним для стандарту 8, що відповідає порожньому значенню. Розрахована функція була доступною у наступному вигляді: Стандартна крива TGF-β 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0033x + 0,0325 R² = 0,9803 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Концентрація [нг/мл] Рис. 2-4 Стандартна крива TGF-β фотометрична оцінка стандартних розчинів TGF-β Після вирішення формули для x період часу 0 хв. використовували до x хв кожного зразка сироватки. Визначені таким чином значення x відповідали концентраціям TGF-β зразка сироватки, скоригованим на значення порожньої величини, і були перенесені в таблиці Microsoft Excel, статистично оцінені за допомогою GraphPad Prism та відображені графічно.

2 Матеріал та методи 42 EtBr Glycerol SIGMA (Cat-No: E1385-5ML) SIGMA (Cat-No: G8773-500ML) peqgold Universal Agarose Peqlab (Cat-No: 35-1020) puc19-marker ROTH (Cat- №: X901.1) Taq полімерази 1000 U Axon Labortechnik (Кат. No: 22466) Реакційний буфер Taq-Полімерази 10 BD MgCL 2 dntp-суміш 10 мм на нуклеотид Axon Labortechnik (Cat. No: 24478) Tris (гідроксиметил ) амінометан Mastercycler еп градієнт PowerPac TM HC Блок живлення Gel ix Imager SIGMA (Cat. No: T87602-3KG) Eppendorf AG, D-Hamburg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-Munich Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen Intas Steuer Програмне забезпечення для збору зображень Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen 2.6.3.2 Принцип ПЛР та гель-електрофорезу ПЛР - це метод, який дозволяє вибірково ампліфікувати певні ділянки ДНК in vitro. Для цього пробірки, заповнені кдн і реакційною сумішшю, проходять протягом 40 циклів у пристрої, такому як градієнт Mastercycler ep. Кожен цикл складається з 3 етапів: 1. Денатурація При 95 ° С існуючі водневі зв’язки між ланцюгами або праймерами ДНК розриваються, так що залишаються лише окремі ланцюги. Під час ініціалізації цей крок продовжується на 5 хвилин, щоб відключити якомога більше рядків.