Тест на батьківство Анатомія та фізіологія
Тест на батьківство - це генетичний тест, який визначає, чи є особа біологічним батьком дитини чи ні. Генетичні докази батьківства дуже корисні, особливо в судовій медицині. Існують також тести на материнство, які застосовуються набагато рідше, особливо у випадках відпустки у зв’язку з вагітністю та пологами, вбивства дітей або усиновлення. У минулому для встановлення батьківства використовували різні методи, такі як аналіз антигенів групи крові, аналіз антигенів HLA, аналіз лейкоцитарних антигенів або аналіз різних білків та ферментів, але всі вони не дали надійних результатів.
Визначення тесту на батьківство
Тест на батьківство - це лабораторний аналіз 16 послідовностей ДНК, розташованих на різних хромосомах, щоб встановити впевненість у тому, що людина є біологічним батьком дитини. Біологічні зразки вимагаються від передбачуваного батька та дитини, аналізуючи 16 маркерів або послідовності ДНК від кожного, причому аналіз ДНК є єдиним, що забезпечує впевненість у визначенні ступеня спорідненості. Зразки, отримані від двох осіб, порівнюються шляхом аналізу кожного маркера окремо та встановлення взаємодоповнюваності між маркерами від дитини та маркерами від батька. Якщо зразки також беруть у матері, ступінь специфічності тесту зросте, але це не обов'язково потрібно, тест має специфічність 99,9%, а у випадку відбору двох зразків, одного від передбачуваного батька та одного від дитина. Тест можна проводити як в пренатальному, так і в постнатальному періоді.
У Румунії вартість тесту на батьківство становить від 750 (мати проходить тестування, передбачуваний батько та 1 дитина) та 1500 RON (тестується мати, два передбачувані батьки та двоє дітей), залежно від методу тестування, зібраної біологічної проби та кількість аналізованих зразків.
Результат доступний через 3 - 7 робочих днів з моменту надсилання тестів до лабораторії, але це може зайняти навіть більше часу, залежно від техніки, що використовується лабораторією, яка проводить аналіз.
Це також можна визначити братство (спорідненість між 2 і більше дітьми) і визначення ступеня спорідненості між дитиною та різними членами сім'ї (тітками, дядьками, бабусями та дідусями). Він також може встановити ДНК-профіль людини, обох профіль ядерної ДНК а також Мітохондріальна ДНК так само, як Тестування Y-хромосом для встановлення спорідненості між особами чоловічої статі (батьківська спорідненість).
Тестування на подвійний зигоз проводиться з використанням тих самих методів, що і тест на батьківство, і можна визначити, чи є близнюки монозиготними (ідентичними) чи дизиготними.
Пренатальне тестування
1. Амніоцентез.
2. Біопсія ворсин хоріона.
Дозволяє раннє тестування, починаючи з 10-13 тижнів вагітності. Він передбачає вилучення невеликої частини плаценти з матки. Це інвазивна процедура, яку можна проводити трансцервікально (підхід від піхви, проходження через шийку матки до матки) або трансабдомінально за допомогою тонкої і тонкої голки під керівництвом УЗД. Хоріальні ворсинки - це дрібні тканинні розростання пальця рукавички, що виступають із стінки матки. Вони мають генетичний матеріал, ідентичний генетичному матеріалу плода. Ускладнення представлені трансвагінальною кровотечею та розривом плацентарних оболонок після процедури. Для тесту необхідно зібрати 2-3 мм тканини.
Як амніоцентез, так і біопсія ворсин хоріона - це рутинні тести, які проводяться пренатально не лише для встановлення батьківства, але також для визначення аномалій генетичного матеріалу та діагностики генетичних захворювань та хромосомних аномалій, діагнозу, який можна вибрати для аборту (аборту) терапевтичний). У цьому відношенні біопсія ворсин хоріона має перевагу, оскільки її можна проводити швидше, починаючи з 13 тижня вагітності. Збір, як у випадку амніоцентезу, так і у випадку біопсії ворсин хоріона, буде проводитись тільки гінекологом і лише під керівництвом УЗД.
3. Мікрочип SNP (мікрочип поліморфізму з одним нуклеотидом)
- це неінвазивна технологія визначення батьківства шляхом аналізу циркулюючої ДНК плода, витягнутої з материнської крові. Тест можна проводити, починаючи з 10 тижня вагітності. Проаналізовано ДНК плода, ДНК матері та ДНК від передбачуваного батька. Проаналізовано 317 000 генетичних маркерів, представлених нуклеотидами, і встановлено батьківство на основі їх комплементарності. Точність цього тесту становить 99,9%, і він має тенденцію замінити такі інвазивні тести, як амніоцентез та біопсія ворсин хоріона.
Постнатальне тестування
Обов’язковими зразками для проведення аналізу є ті, що відбираються у дитини та передбачуваного батька. Не є обов'язковим тестування зразка від матері, але його наявність збільшує достовірність результату та ймовірність підтвердження батьківства.
Методи випробувань
1. Ланцюгова реакція полімеризації
Техніка ПЛР
Це метод, за допомогою якого послідовність ДНК посилюється in vitro. Природна ДНК проходить процес реплікації або синтезу, в результаті чого нова послідовність ДНК синтезується за допомогою послідовності материнської ДНК, яка називається матрицею. ПЛР проводить реплікацію ДНК в лабораторії. Це призводить до збільшення кількості даної послідовності ДНК, яку потім можна проаналізувати. Для реакції необхідні:
- зразки ДНК, що підлягають аналізу (від передбачуваного батька, матері та дитини), які будуть застосовані (так звана матрична ДНК)
- ДНК-полімераза
- праймери (олігонуклеотиди)
- реакційний буфер
- Іони магнію
Реакція включає термічну денатурацію матриці ДНК з вивільненням подвійної спіралі, приєднання праймерів та полімеризацію. В кінці першого циклу полімеризації (ампліфікації) отримують подвійну кількість ДНК порівняно з кількістю ДНК-матриці. Проводиться від 25 до 40 циклів посилення. Мінімальна кількість матричної ДНК для успіху реакції становить 500 нанограмів ядерної ДНК. Використовувані праймери є штучними і повинні доповнювати 5 'і 3' кінці ділянки ДНК, що підлягають ампліфікації. ДНК-полімераза, що використовується для реагентів, отримується з теплолюбних мікроорганізмів і повинна бути термостабільною, щоб витримувати температури, при яких здійснюється ланцюгова реакція полімеризації (100 градусів Цельсія). Найчастіше використовується ДНК-полімераза Taq, або Taq Pol, отриманий від мікроорганізму Termus Aquaticus. Taq Pol витримує всі три діапазони температур, при яких проводиться ПЛР, а саме: 90 - 95 градусів Цельсія для денатурації матриці ДНК і розгортання подвійної спіралі, 55 - 60 градусів для приєднання праймерів до кожної з двох ланцюгів денатурованої матриці ДНК, і 72-75 градусів для реакції полімеризації.
Стадії ланцюгової реакції полімеризації:
а. Денатурація дволанцюжкової ДНК
Він виготовляється при температурі понад 90 градусів, протягом 20-30 секунд, з розбиванням дволанцюжкової ДНК на дві взаємодоповнюючі матричні ланцюги, до яких потім будуть прикріплені праймери. Отже, наприкінці цього етапу дві вільні одноланцюгові ланцюги ДНК приведуть до реакційного середовища.
b. Зчеплення одноланцюгових праймерів ДНК
Це триває 20-40 секунд, протягом яких температура знижується до 55-60 градусів. Результат - гібридна дволанцюжкова ДНК.
в. Розширення праймерів
ДНК-полімераза зв'язуватиметься з гібридною дволанцюжковою ланцюгом ДНК, зчитуючи послідовність матричної ланцюга ДНК і подовжувати праймери на основі правила комплементарності між азотистими основами.
Фази посилення:
- Експоненціальне посилення - подвоєння кількості ДНК в кінці кожного циклу полімеризації
- Вирівнювання - Коли витрачаються реагенти, реакції будуть протікати повільніше
- плато - виснаження реагентів
2. Поліморфізм довжини фрагмента обмеження
Методика включає фрагментацію послідовності ДНК з використанням ферменти рестрикції. Отримані фрагменти розділяють відповідно до їх довжини за допомогою електрофорезу в агаровому гелі, а потім переносять на спеціальну мембрану за процедурою Саузерн-блот. Всі зразки від матері, передбачуваного батька та дитини аналізуються одним і тим же методом і порівнюються згідно комплементарності послідовностей ДНК з однаковою довжиною. Метод RFLP вважається золотим стандартом для генотипування, але обмежується тим фактом, що ДНК зразків, що надходять на тест, повинна бути винятковою якістю, щоб мати можливість розділятися на фрагменти. Тривалість тесту також дуже велика, коливається від 3 тижнів до 3 місяців, тоді як тест ПЛР триває від 3 до 9 днів.
Тест на батьківство представляє єдиний метод усунути невизначеність щодо встановлення біологічного батька дитини, будучи генетичним тестом зі 100% точністю при усуненні осіб, які не відповідають статусу біологічного батька, та 99,9% точності при визначенні особи з біологічним статусом батька. Результат оприлюднюється приблизно через тиждень після отримання зразків, але навіть у Румунії є лабораторії, які працюють в аварійному режимі, надсилаючи результат через 8 годин.