Товариство диференціації та проліферації Макса Планка
Відділ розвитку та модернізації серця (проф. Д-р д-р Томас Браун)
MPI для досліджень серця та легенів, Бад-Наухайм
(1) Диференціація та проліферація клітин під час розвитку та регенерації
Молекулярний контроль диференціації та регенерації у пошкодженому та старіючому серці
Відповідно до загальної доктрини, доросле серце складається з диференційованих кардіоміоцитів (клітин серцевого м’яза), які вже не здатні ділитися. Оскільки серце людини може працювати безперервно і ефективно протягом десятиліть, передбачалося, що окремі кардіоміоцити також переживають цей період без серйозних змін. Однак різні дослідження показали, що старіння та пошкодження серця неминуче призводять до втрати клітин через так звану програмовану загибель клітин (апоптоз) з подальшими змінами тканин (некроз). З цього можна зробити висновок, що дорослі кардіоміоцити все ще мають залишкову здатність до самовідновлення, і що це важливо для підтримки нормальної роботи серця. Поки що невідомо, які сигнали та процеси визначають баланс між загибеллю клітин, виживанням клітин та їх поділом.
Робоча група МПІ з досліджень серця та легенів у Бад-Наухаймі шукає фактори росту, які могли б контролювати цей делікатний баланс. Одним з цих факторів, можливо, є BMP-10, новий член сімейства BMP (морфогенетичні білки кісток), який специфічно експресується в м'язових кульках, званих "трабекулами" в тканині серця та передсерді (передсерді) серця миші, що розвивається. У гомозиготних мутантних мишей BMP-10 рано виникає дисфункція серця, що може бути обумовлено, зокрема, відсутністю трабекуляції, що призводить до загибелі мутантних ембріонів між Е10,5 і 11,5 п.е. (після копуляції) відводить. У культурі тканин BMP також захищають кардіоміоцити від апоптозу. Оскільки BMP-10 має високу експресію у серцях дорослих мишей та людей, дослідники проаналізують роль BMP-10 у виживанні та старінні кардіоміоцитів на трансгенних моделях мишей. Вони очікують, що більш глибоке розуміння ролі BMP призведе до нових терапевтичних методів при серцевих захворюваннях (Рис.1).
Репараційні процеси в старіючому або пошкодженому серці характеризуються утворенням нефункціональної рубцевої тканини. Як пояснювалося вище, регенерація старіючих сердець неможлива через обмеження здатності клітин серцевого м’яза дорослих ділитися та відсутність достатньої кількості стовбурових клітин серця. Тому вчені з MPI намагаються зламати мітотичний блок кардіоміоцитів, маніпулюючи клітинною апаратурою. Зокрема, вони досліджують роль факторів транскрипції E2F та каталітичної субодиниці ферменту теломерази у ініціюванні клітинного циклу та потенційне використання домінантних негативних версій p53 та p73 для запобігання апоптозу клітин серцевого м’яза.
Дослідники: Ізабелла П’єтровська, Томас Кубін, Жипей Лю
У верхній частині знімка показано серце миші після перев'язки коронарного судини LAD. Перев'язка артерії призводить до добре помітного масивного інфаркту. У нижній частині зображення в серце введено аденовірус, який експресує репортерний ген, який можна зробити видимим у простому синьому кольорі. Перенесення генів у серцеву тканину представляє майбутній варіант лікування серцевої недостатності.
Серцева регенерація зеленого тритона (Notophtalmus viridescens)
Деякі організми мають здатність стимулювати клітини, які є постмітотичними для інших видів, знову входити в клітинний цикл і навіть регенерувати цілі органи або частини органів. Добре відомим представником цього сімейства тварин є тритон Notophtalmus viridescens, який відомий своєю здатністю регенерувати ампутовані кінцівки або хвости та деякі інші структури. N. viridescens є одним з небагатьох хребетних, який також здатний регенерувати м’язову тканину серця (Рис.2). Група вчених з MPI у Бад-Наухаймі порівнює профілі експресії неушкодженої та регенеруючої тканини серця, щоб виявити молекули, які контролюють регенеративну здатність серця тритона. Дані цього скринінгу порівнюються з результатами подібних екранів мишачої моделі інфаркту міокарда. До цього часу дослідники створили ДНК-чіпи зі 100 000 кДНК і використали їх для ідентифікації генів, які демонструють диференціальну експресію в регенеруючому та спокійному серці. Детальний функціональний аналіз молекулярного шляху, що визначає серцеву регенерацію у тритонів, є наступним кроком, який в даний час здійснюється за допомогою різних підходів.
Дослідники: Тіло Борхадт, Джулія Крузе, Томас Кубін, Томас Беттгер, Рене Циммерманн
Показаний "водяний тритон із червоними крапками, зеленуватий водний" (Notophtalmus viridescens), у якого була пошкоджена частина серця (область, окреслена білим кольором). Інтактні клітини серцевого м’яза, які практично відсутні на пошкодженій ділянці, пофарбовані в зелений колір. На відміну від людей, тритон може відновлювати пошкоджену ділянку, а також у зрілому віці абсолютно нормальне серце.
Ідентифікація генів, що контролюють диференціацію кардіоміоцитів
У минулому були виявлені різні гени, які сприяють диференціації кардіоміоцитів та морфогенезу серця. Тим не менш, дуже ймовірно, що значно більша кількість генів відіграє роль у конкретній формі серця. Комплексних функціональних підходів до ідентифікації таких генів для ссавців ще не існує. Дослідницька група MPI використовує стратегію широкого екрану геному, засновану на диференціації ембріональних стовбурових клітин. Вона використовує складні ретровірусні бібліотеки siRNA для виявлення генів, які відіграють вирішальну роль у диференціації кардіоміоцитів. Ідентифіковані гени використовуються для диференціації ембріональних стовбурових клітин (ES клітин) в пробірці шляхом формування ембріоїдних тіл (ЕВ; 3B) і в природних умовах з використанням тетраплоїдних агрегованих химер.
Дослідник: Андре Шнайдер, Томас Беттгер, Дітмар фон дер Ахе
Диференціація ембріональних стовбурових клітин (ES) на кардіоміоцити після обробки ембріональних тіл (EB) фактором росту FGF-2 протягом трьох днів. В: недиференційовані клітини; B: Ембріональні тіла після 3 днів лікування FGF-2; C: Саркомер MyHC (MF-20) позитивні кардіоміоцити, диференційовані від ембріональних тіл після обробки 3ng/мл FGF-2.
Старіння серця та окислювальний стрес: гени SIR та контроль енергетичного обміну
Реактивні форми кисню (АФК = кисневі радикали) спричиняють безліч дегенеративних змін у клітині та призводять до передчасного старіння клітин. Загалом накопичення АФК вважається основною причиною збільшення старіння клітин. Тканини, які складаються в основному з постмітотичних клітин, виявляються особливо чутливими до пошкодження АФК, оскільки вони мають лише обмежений потенціал для регенерації. Поки що точні взаємозв'язки між окислювальним стресом та старінням до кінця не відомі Рис.4. Однак очевидно, що підвищений окислювальний стрес призводить до нестабільності в енергетичному обміні. Незбалансований енергетичний метаболізм, ймовірно, призводить до зниження активності сімейства генів SIR (регулятор тихої інформації). Ймовірно, гени SIR інактивують спеціальні домени хроматину (шляхом деацетилювання NAD-залежних гістонів) і тим самим виконують захисну функцію. Згідно з цією ідеєю, надмірна експресія SIR2 у дріжджах (Saccharomyces cervisiae) до значного збільшення терміну служби.
Вчені з MPI для досліджень серця та легенів створили різні лінії миші, які дозволяють їм досліджувати роль окисного стресу, старіння та інактивації хроматину. З цією метою вони сконструювали умовно активний алель SOD2 (супероксиддисмутази), який забезпечує інактивацію та активацію гена в певний час у серцевому м’язі. У другій серії експериментів кДНК SIR2 штучно надмірно експресується в серці. Крім того, вони досліджують вплив нормальної калорійності та гіпокалорійності їжі на окислювальний стрес та старіння клітин за допомогою відповідних профілів експресії кардіоміоцитів. Вони також аналізують зв'язок між окислювальним стресом та інактивацією генного хроматину шляхом схрещування мишей з дефіцитом SOD2 та мишей, у яких SIR2 надмірно виражений.
Дослідники: Єва Бобер, Сюзанна Вайнліх, Олеся Вакрушева
Фермент "Манганізована супероксиддисмутаза (MnSOD)" підвищує рівень виживання фібробластів в гіпероксичних умовах. Контрольні фібробласти та ті, які надмірно експресують MnSOD, культивували в нормальних (20% O2 = "нормоксія") та гіпероксичних (85% O2 = гіпероксія) умовах. Фазово-контрастні зображення зафіксували значно вищий рівень виживання при окисному стресі в клітинах, що надмірно експресують MnSOD. Надмірне вираження MnSOD можна розпізнати за зеленою флуоресценцією (ліва сторона та центр). Права сторона зображення: Синій забарвлення документує індуковане старіння (старіння) клітин після введення 200 нм доксорубіцину. У клітинах з надмірною експресією MnSOD старіння в основному запобігається.
Контроль міграції клітин-попередників м’язів за допомогою індуктивних та автономних сигналів від клітини
Міграція є важливою властивістю міогенних клітин (клітин-попередників м’язів) під час органогенезу та регенерації органів. У минулому дослідники змогли показати, що ген Homeobox Lbx1 регулює міграцію клітин-попередників м’язів у кінцівках автономно. Їх результати довели, що Lbx1 є ключовим регулятором міграції клітин-попередників м’язів і необхідний для цілеспрямованої міграції клітин-попередників м’язів задньої кінцівки та м’язів-розгиначів передньої кінцівки (Рис.5). Використовуючи віднімання кДНК гетерозиготних та гомозиготних мутантних клітин Lbx1, вченим вдалося ідентифікувати різні передбачувані гени-мішені Lbx1. В даний час триває функціональне дослідження цих генів. Крім того, робоча група досліджує каскади передачі сигналу, необхідні для рухливості клітин та міграції клітин-попередників м’язів у дорослих мишей та курячих ембріонів.
Дослідники: Штефан Гюнтер, Світлана Устаніна
Дезактивація гена Homeobox Lbx1 призводить до зупинки міграції клітин-попередників м’язів у кінцівки. Ген бактеріального репортера був введений в ген Lbx1 шляхом цілеспрямованого мутагенезу. Цей генетичний фокус, з одного боку, вимикає активність гена Lbx1, а з іншого - робить видимими клітини, в яких зазвичай містився Lbx1. Перший і третій ряди демонструють гомозиготних мутантів, другий і четвертий ряди гетерзиготних мутантів. На знімках c і i добре видно, що клітини попередників м’язів, позначені синім кольором, не можуть мігрувати в задню кінцівку, а „застряють” у тулубі.
Регулювання маси тіла та роботи серця за допомогою нейронних генів bHLH
В рамках скринінгу на нейронально експресовані гени bHLH (фактори транскрипції, що містять основний домен спіралі петля-спіраль), дослідники з MPI у Бад-Наухаймі змогли ідентифікувати ряд різних кДНК та генів кілька років тому. Зокрема, вони аналізують два гени NSCL1 і NSCL2. Хоча інактивація NSCL1 не призвела до помітних дисфункцій нейронів, миші-мутанти NSCL1 передчасно гинуть, імовірно, в результаті серцевих дисфункцій, які можуть бути спричинені вегетативною дисфункцією. Миші з дефіцитом NSCL2 також страждають від численних нейроендокринних розладів (Рис.6). Комбінована інактивація обох генів призводить до зменшення проліферації нервових клітин і порушення диференціації в нюховому епітелії.
Дослідників цікавлять молекулярні та фізіологічні процеси, що лежать в основі цих фенотипів. Особлива увага приділяється аналізу генів-мішеней NSCL1 та NSCL2 та зв'язку між проліферацією та диференціацією клітин. Одним із напрямків майбутньої діяльності в цьому проекті є дослідження функції NSCL2 у дорослому організмі та механізму порушень серцевого ритму та вегетативних дисфункцій у мутантів NSCL1.
Дослідник: Карен Рушке, Томас Шмідт
Ожиріння через дисфункцію нервової системи: цілеспрямована інактивація основного фактора транскрипції NSCL-2, що експресується у нейронах, у мишей призводить до вираженого ожиріння. Зовнішній вигляд миші схожий за своїм молекулярним підписом на синдром людини Прадера-Віллі.
(2) Поліпшення та прискорення регенерації тканин: відновлення та заміна пошкоджених клітин серця та скелетних м’язів
Регенеративна медицина - це нова захоплююча сфера біологічних та медичних досліджень. Він заснований безпосередньо на результатах базових досліджень, що стосуються диференціації та розвитку клітин. Пізніші висновки припускають, що попередні рішення, прийняті клітинами, не є незворотними, але можуть бути скасовані та змінені. Така «динамічна концепція пошуку ідентичності клітини» базується на ідеї, що підтримка клітинного фенотипу вимагає постійного регулювання. В принципі, це означає, що повинна бути можливість перепрограмувати диференційовані клітини і тим самим посилити регенеративні властивості тканин і органів.
Відбір та маніпуляції мезенхімальними стовбуровими клітинами для утворення міобластів та кардіоміоцитів
Мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) трапляються в стромі (підтримуючі тканини) різних органів. Кістковий мозок містить MSC, які здатні набувати властивостей різних типів клітин, включаючи серцеві та скелетні м'язи та нейроектодермальні клітини (Рис.7). Використання генетично позначених МСК, отриманих з кісткового мозку, дозволило дослідникам зрозуміти потенціал диференціації МСК в природних умовах приймати після ін’єкції в ранні ембріони миші. Поєднуючи конкретні стратегії генетичного відбору та протоколи індукції, вдалося отримати відносно однорідні популяції клітин, які мають характеристики м’язових клітин і, за необхідності, можуть бути використані в терапевтичних цілях.
Крім того, група працює над оптимізацією методів для ефективного відбору та розширення МСК для генерації міобластів та кардіоміоцитів. Вони також визначають терапевтичний потенціал цих клітин. Однак такий підхід може бути успішним лише в тому випадку, якщо є можливість дізнатись більше про сигнали та процеси, необхідні для визначення та диференціації на різні клітинні лінії.
Дослідник: Фікру Белема Бедада, Керстін Бройч
Мезенхімальні стовбурові клітини, схоже, переважно приймають свою ідентичність шляхом злиття з існуючими скелетними та серцевими м’язовими клітинами. Цей висновок випливає з показаного експерименту, в якому мезенхімальні стовбурові клітини маркували червоним барвником і культивували зеленими м’язовими клітинами над мембраною з порами різного розміру. Мезенхімальні стовбурові клітини могли експресувати м’язовий білок (оранжевий) лише тоді, коли розмір пор фільтра був достатнім, щоб клітини могли вільно проходити. Якби це не було гарантовано, у мезенхімальних стовбурових клітинах не було б виявлено м’язових білків.
Клітини-супутники: контроль проліферації, виходу з клітинного циклу та диференціації під час регенерації тканин
Клітини-супутники - це стовбурові клітини скелетних м’язів. Вони розташовані між базальною пластиною та плазматичною мембраною (сарколемма) міотрубок, де активуються під час фізичних вправ, травм м’язів або захворювань, що пошкоджують м’язові волокна. Вчені аналізують механізми, що контролюють проліферацію, вихід клітинного циклу та диференціацію клітин-супутників під час регенерації м'язової тканини (Рис.8). Пересадивши генетично марковані клітини від мишей-мутантів з цільовими мутаціями в сімействі генів фактора росту FGF, вони показали, що міогенні стовбурові клітини автокринно залежать від FGF. Використання домінантних негативних ретровірусів дозволяє припустити, що FGF ініціюють ras і ral-залежний каскад, який ініціює міграцію клітин.
Дослідники визначають потенціал загальних та генетично модифікованих факторів росту для терапії та профілактики захворювань скелетних м’язів у трансгенних тварин як доклінічну модель. Використовуються два різні підходи: 1) створення трансгенних моделей тварин для аналізу функції факторів росту, насамперед FGF, міостатину та SF/HGF; 2) Відбір генетично модифікованих факторів росту на основі міостатину із модифікованим біологічним спектром. Аналіз факторів росту під час регенерації підтверджується експериментами, що вивчають функцію клітинно-автономних процесів при активації та підтримці супутникових клітин.
Дослідники: Світлана Устаніна, Міхал Мелькарек, Штефан Гюнтер, Андре Шнайдер
Парний ген боксу Pax7 відповідає за підтримку пулу м'язових стовбурових клітин. Синій колір вказує на активність гена Pax7 у клітинах-супутниках, які розташовані на ізольованих м’язових волокнах у “супутниковому положенні”. У мутантів мишей Pax7 кількість супутникових клітин лише незначно зменшується протягом молодості миші (P 11), але вона швидко зменшується із збільшенням віку (P 60). Крім того, мутантні клітини-супутники Pax7 демонструють втрату експресії маркера стовбурових клітин CD34.