Universitätsklinikum Hamburg - Eppendorf - PDF скачати безкоштовно
Університетський медичний центр Гамбурга - Центр експериментальної медицини ім. Еппендорфа Інститут молекулярно-клітинної біології Директор: проф. вип. Фізіол. Лікар. H. c. Ульріке Бейзігель Про механізм гепатомегалії при захворюваннях на перевантаження залізом. Дослідження експресії генів на моделі тварини на щурах Дисертація на здобуття наукового ступеня ДОКТОРА МЕДИЦИНИ медичного факультету Гамбургського університету Гамбург - Еппендорф, представлена: Ехсаном Хальяні, народженим у Тегерані/Іран Гамбург 2010
Прийнято медичним факультетом: 25.10.2010 Опубліковано з дозволу медичного факультету Гамбургського університету Науковий нагляд: PD Dr. Лікар. Ревізійний комітет Пітера Нільсена, голова: проф. Лікар. Ульрієке Бейзігель Екзаменаційна комісія: 2-й рецензент: PD Dr. Лікар. Пітеранська комісія Пітера Нільсена: 3-й рецензент: проф. Р. Бьогер - 1 -
Зміст 1. Вступ Метаболізм заліза 5 Медичне значення заліза 12 Печінка: функція та фізіологія 16 Збільшення печінки 17 Опис тваринного зразка та значення жирової групи 18 Принцип перевантаження заліза TMH Ferrozen 19 Гістологія 20 Зміни у експресії генів у моделі щурячих тварин 20 Питання 27 2. Експерименти (матеріал і методи) Сонографічне дослідження обсягу печінки 28 Визначення концентрації заліза в печінці in vivo за допомогою SQUID 29 Статистична оцінка даних пацієнтів 30 Модель тварини на щурах із замороженим TMH 32 Видалення печінки 33 Визначення концентрації заліза в печінці щурів in vitro 34 Гістологічна обробка печінки щурів 35 Виділення ДНК, білків та РНК для rt rt ПЛР 36 РНК-гель-електрофорез 38 Транскрипція РНК в кдн 40 Генерування та впорядкування праймерів 41 Проведення rt rt ПЛР 44 Статистична оцінка даних rt rt ПЛР 45 Електрофорез ДНК-гелю 49 Проведення вестерн-блотингу з p-актом 5 0-3 -
3. Результати Статистична оцінка даних пацієнта 51 Обсяг печінки щурів 53 Визначення концентрації заліза в печінці щурів in vitro 54 Гістологічна обробка печінки щурів 55 Вага печінки щурів 56 Оцінка rt rt ПЛР та результати вестерн-блот 57 Електрофорез ДНК-гелю 68 4. Обговорення Обговорення даних пацієнта 69 Обговорення Гістологія 70 Обговорення даних rt rt ПЛР та вестерн-блотів 71 Висновок 77 5. Резюме 80 6. Список скорочень 82 7. Джерела та посилання 83 8. Додаток (додатки) rt rt ПЛР-криві 88 ДНК-гель-електрофорез 88 Загальний файл подачі 92 9. Подяки 93 10. CV 94 11. Свідчення 96-4 -
Рис.2 Залізо потрапляє в організм двома шляхами. Або через HCP1 у формі гему, або у вигляді відновленого рослинного заліза через DMT1. За допомогою гемоксигенази залізо звільняється від гему. За словами Донована та співавт. (Physiology 21: 115-123,2006), тут він перетворюється у свою тривалентну форму за допомогою Гефестіна, що містить мідь ферооксидазу, з метою зміни його розчинності і, нарешті, зв’язаного з трансферином, доставленого до місця призначення (11). Рис.3: Положення Гефестина на базолатеральній стінці ентероцитів. Тут залізо перетворюється у його тривалентну форму і зв’язується з трансферином. Мутація ферропортину при аутосомно-домінантному гемохроматозі: втрата функції, посилення розуміння, Fleming et al (2001) - 7 -
Те саме стосується і рецептора трансферину. Рис.6 Білки, що регулюють залізо, зв'язуються з 3-кінцем мРНК рецептора трансферину до характерної структури стовбурової петлі і таким чином забезпечують зменшений розпад мрна (незначна деградація). За даними Санчеса та співавт. (2006) За допомогою цього механізму залізо вбудовується в залізо-сірчаний кластер IRP1 (IRP1 відокремлюється від IRE), завдяки чому поглинання заліза зменшується через знижену експресію DMT1 і цикл, описаний вище, може розпочатися знову . Показане регулювання, однак, може мати місце і на неперекладеному кінці мрна, де може спостерігатися протилежний ефект, тобто обмеження в перекладі (21, 22). Рис.7 IRP зв'язуються з 5 кінцем ферритової мРНК і, таким чином, запобігають трансляції мрна. За даними Sanchez et al (2006) - 10 -
Тим часом відомо багато генів, що несуть мотиви IRE, які навіть можна успішно ідентифікувати біорозрахунково, без масивів. Біовичислювальний означає запис мотивів за допомогою спеціального програмного забезпечення для комп’ютерного пошуку на основі відомих послідовностей мрна в PubMed. Рис. 8 Представлення генів, що несуть IRE, які були ідентифіковані біокомпутаційними. Регуляція заліза та клітинний цикл, M Sanchez et al., J Biol Chem.2006 11 серпня; 281 (32): 22865-74. Epub 2006 7 червня Після того, як поглинене залізо транспортується до клітини-мішені за допомогою трансферину, залізо зберігається у феритині у вигляді полімерного оксиду-гідроксиду-фосфату заліза. Рис.9 Це зображення феритину, отримане за допомогою рентгенівської кристалографії, показує запас мінерального заліза в центрі феритинового ядра (коричневий). За даними Casidy et al. 2004 Ферритин здатний вивільняти залізо із запасів або продовжувати зберігати залізо залежно від потреб організму. - 11 -
Рис.11: Принцип перекисного окислення ліпідів та його наслідки За даними Nielsen et al (2006), відомо багато інших клінічних картин у зв'язку із перевантаженням залізом, хоча ступінь вираженості симптомів залежить від відповідних генетичних змін. Міокардіоцити зберігають залізо, що призводить до токсичного фіброзу міокарда. У підшлунковій залозі гемохроматоз може призвести до фіброзу підшлункової залози з плюригландулярною недостатністю, що може призвести до вторинного цукрового діабету. Це також називають бронзовим діабетом через існуючу надмірну пігментацію шкіри. Сидероз плазматичних клітин часто можна діагностувати в кістковому мозку, що характеризується грубим внутрішньолізосомним відкладенням заліза поблизу ядра (28). Поклади заліза в усіх випадках виявляються за класичним прусським синім кольором. Комплекс хвороб гемохроматоз поділяється на чотири підформи. Симптоми та ступінь тяжкості різні. Гемохроматоз типу 1 є найпоширенішою підформою у західному світі (29), а також є предметом досліджень пацієнтів у цій докторській дисертації. - 14 -
Залізо печінки (мг/г ваги печінки) 35 30 25 20 15 10 5 0 Концентрація заліза в печінці за допомогою TMH-Заморожене годування H мохроматозою 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Час годування в тижнях Рис. 14 На малюнку показано хід зберігання заліза в печінці у мг/г ваги печінки щодо тривалості годування. Зі збільшенням часу годування досягається плато у кількості заліза в печінці. Нільсен 2006 1.7. Гістологія Попередні дослідження ще не змогли з'ясувати, чи збільшилася печінка у щурів через перевантаження заліза гіпертрофованою чи збільшилася в обсязі внаслідок поширення. Ще не виключено запалення. 1.8. Зміни в експресії генів у моделі тварин на щурах На підставі припущення, що перевантаження заліза та жиру призведе до змін у експресії генів, досліджували транскрипцію репрезентативних маркерів для метаболічних шляхів, про які йдеться (рис. 15), що буде більш докладно обговорено нижче. Рис.15 Печінка в центрі різних обмінних процесів - 20 -
Рис. 17 IGF-1 як частина осі печінка-кістка гіпофіза гіпофіз. IGF-1 знаходиться під безпосереднім впливом гормону росту і є медіатором гіпертрофії. Джерело: http://www.mfi.ku.dk Білки-носії (IGF-BP 1-6 = Інсуліноподібний фактор росту - зв'язуючий білок) зв'язуються з плазмою після секреції IGF-1, а також перебувають під гормоном росту та контроль інсуліну. Ці гормони визначають, коли IGF1 може відірватися від своїх зв’язуючих білків, перейти в активну форму і, нарешті, зв’язатися зі своїм рецептором (IGF-R = інсуліноподібний фактор росту). Завдяки своїй тетрамерній структурі та внутрішньоклітинній активності тирозинкінази, IGF-R нагадує рецептор інсуліну і дозволяє IGF-1 ініціювати внутрішньоклітинні каскади сигналів. Тоді результатом сигнальної послідовності є посилений біосинтез білка, пригнічення протеолізу, включення тимідину в ДНК та включення сульфатів у протеоглікани (24). Вплив маркерів гіпертрофії також спостерігали на рівні білка. Фосфорилювання АКТ-1 розглядали із вестерн-блот. - 24 -
18 IGF-1 та сигнальний шлях AKT безпосередньо пов'язані між собою в антиапоптотичних шляхах. Джерело: www.biocarta.com, змінено з Khaljani 2008 AKT-1 є протеїнкіназою для різних сигнальних каскадних шляхів (таких як апоптоз, процеси клітинного циклу, анігіогенез), але AKT-1 безпосередньо пов'язаний з IGF-1. Таким чином, AKT-1 опосередковує антиапоптотичний ефект IGF-1, збільшуючи його. Гіпертрофію без підвищення АКТ-1 можна здебільшого виключити, оскільки вона також є центральним посередником у шляхах гіпертрофії. Проте слід враховувати різні фактори, що впливають на залізо на АКТ, оскільки залізо як шкідливий агент втручається в різні метаболічні шляхи. Гени запалення Надмірне зростання клітин може мати інші причини, крім проліферації та гіпертрофії. У цьому контексті збільшення печінки можливе в процесі запального процесу, що ми хотіли спостерігати, розглядаючи маркери запалення. Прозапальний маркер, класично цитований у літературі, - це TNF-a (фактор некрозу пухлини-a), який ми, таким чином, також обрали для нашого дослідження. - 25 -
1.9. Питання У цьому дослідженні слід відповісти на такі запитання: 1. Чи призводить перевантаження заліза до гепатомегалії у людей, як і у щурів? 2. Чи можливе збільшення печінки у пацієнтів безпосередньо залежить від концентрації заліза в печінці? 3. Які гени відіграють важливу роль у збільшенні печінки, викликаному залізом, у щурів: проліферація, гіпертрофія чи запалення та що показує гістологія? 4. Чи викликають перевантаження залізом та жиром подібні реакції на рівні експресії генів та білка? - 27 -
2. Експерименти (матеріал і методи) 2.1. Сонографічне дослідження об’єму печінки Матеріал: - Ультразвуковий прилад: Picker CS 9500 - Ультразвуковий контактний гель: Цезар і Лоріц - Вакуумний матрац: Vac Fix As - Рухома кушетка Для визначення об’єму печінки пацієнти лягають на спину, щоб можна було легко дістати печінку під реберною дугою посилення. Після цього ультразвукові зображення були зроблені в сагітальній площині за допомогою головки ультразвуку під контролем лазера на відстані 2 см. Ділянку печінки потрібно було позначити на зображеннях вручну і помножити на товщину зрізу 2 см. Після підсумовування результатів 8 секційних зображень об’єм печінки був приблизним. Робота проводилась за люб’язної підтримки пана Райнера Енгельгардта та Роланда Фішера з клініки метаболізму заліза Центру жіночої та дитячої медицини, клініки та поліклініки дитячої гематології та онкології Університетської лікарні Еппендорфа. Рис. 19 Витяг з картотеки пацієнта. Зазначаються ідентифікаційний номер (ID), стать (стать), мутація гемохроматозу (C282Y, H63D), діагноз, вага, зріст, а також виміряний об’єм печінки (Vol-liv) та концентрація заліза в печінці (LIC) - 28 -
Спочатку також вимірювали Gs a (альфа-субодиницю стимулюючого білка G), що показало порівнянні дані. Однак GAPDH виявився більш надійним у практичній роботі, так що експресія цільових генів була пов'язана з GAPDH. 3.7. Електрофорез у ДНК-гелях Зображення гелів ДНК можна знайти в додатку. Зображення використовуються для перевірки rt ПЛР на наявність небажаних побічних продуктів та забруднення. ДНК-гель також може бути використаний для визначення того, чи має очікуваний продукт відповідний розмір, що можна перевірити за допомогою сходів на 100 п.н. з лівого боку зображення. Перша, нижня смуга драбини становить 100 п.о., друга - 200 п.н. і т. Д. Оскільки використовувались лише праймери, які демонстрували чисті продукти ПЛР у гелі під час пробного запуску, на всіх зображеннях гелю на відповідному рівні видно лише одну чітку смужку. Кількість залежить від ампліфікованого розміру ДНК, який зазначений у списку праймерів. Контроль ПЛР показує правильний розмір продукту ПЛР на всіх зображеннях та негативно впливає на забруднення. - 68 -