Виділення РНК - біологія
Як жарко занадто жарко для життя глибоко під дном океану?
Антибіотики від бактерій
Міграція клітин: нещодавно виявлена функція відомого білка
Молекулярний компас для вирівнювання клітин
Від чого листя старіє восени
Демократичність грифа-цесарки
Середовище Екембо: Люди також жили на відкритих ландшафтах
| Генетика | Сільське, лісове та тваринництво
Сорт пшениці був створений шляхом схрещування дикорослих трав
Як жарко занадто жарко для життя глибоко під дном океану?
Ізоляція РНК
Ізоляція РНК від клітин дає змогу аналізувати поточну активність клітин у певний момент часу, оскільки лише гени, які в даний час транскрибуються в клітині, доступні як РНК на момент виділення. Таким чином, виділення РНК є важливим методом у молекулярній біології, і ізольована РНК може бути використана у численних методах аналізу експресії генів.
Особливості при роботі з РНК
РНКази (ферменти, що каталізують розщеплення РНК на більш дрібні фрагменти) мають високу стабільність і все ще можуть бути активними після автоклавування. РНК дуже сприйнятлива до деградації РНКазами, природним завданням яких є Mg 2+ -незалежний гідроліз фосфодіефірних зв’язків у фосфатному кістяку РНК. Тому поводження з РНК вимагає більшої обережності, ніж робота з набагато стабільнішою ДНК. Щоб уникнути деградації РНК, РНК та РНКази слід відокремлювати одна від одної на ранній стадії, а також запобігати введенню РНКаз із навколишнього середовища у зразок. Тому слід носити одноразові рукавички, оскільки РНКази виробляються усіма організмами, і тому вони також присутні на поверхні шкіри в людському поту. Крім того, має сенс використовувати певний набір витратних матеріалів (піпетки, коробки для піпеток тощо) лише для експериментів з РНК. Крім того, слід використовувати спеціальну воду без РНКази.
Ізоляція РНК
Як уже зазначалося, при виділенні РНК дуже важливо відокремити РНКази від РНК якомога раніше. Всі методи виділення РНК засновані на лізисі клітин у хімічному середовищі, в якому РНКази швидко денатуруються. Потім РНК відокремлюється від інших клітинних компонентів. Таким чином отримують загальну РНК. Цю загальну РНК можна або використовувати безпосередньо для подальших експериментів (наприклад, Норт-блот, зворотна транскрипція в кДНК), або її можна використовувати як вихідну речовину для виділення мРНК.
Метод Хомчинського та Саккі
Цей метод використовує спеціальний реагент (наприклад, TRIzol Reagent ® від Invitrogen або TriFast ™ від peqLab). Це дає можливість отримувати РНК з клітин або тканини за певним протоколом. Ця процедура заснована на т.зв. "Один крок" Метод Хомчинського та Саккі. Тризол містить гуанідиній тіоціанат, який лізує клітини і одночасно інактивує РНКази та інші ферменти. Реагент також містить фенол, у якому ДНК і білки розчиняються. Фази розділяють додаванням хлороформу, а потім центрифугуванням. Тоді можна розпізнати три фази. Верхня водна фаза містить РНК, інтерфазну ДНК і білки нижньої фази хлороформу. Потім РНК у водній фазі осаджують ізопропанолом або етанолом. Після двох етапів промивання РНК розчиняється, наприклад, у воді без РНКази і доступна для подальшого застосування.
Метод "Нонідет Р-40"
Цей метод не підходить для тканин і використовується для отримання мРНК із цитозолю. Перевага цього методу полягає в тому, що клітинні ядра залишаються цілими, і, отже, існує також можливість виділення ДНК. Принцип заснований на неіонному миючому засобі Nonidet P-40, який додається до клітин, і ДНК (клітинні ядра) осідає у вигляді гранул після центрифугування. РНК, білки та залишки клітин залишаються в розчині. Потім слідує, як і при "Один крок" Метод виділення фенолом/хлороформом.
Комплектні системи
Ще одним варіантом виділення РНК є безліч наборів систем, доступних від різних компаній та у численних версіях (наприклад, RNeasy Mini Kit ® від Qiagen). У цих набірних системах використовуються невеликі колонки, які специфічно зв'язують РНК.
Визначення концентрації за допомогою спектрофотометрії
При визначенні концентрації за допомогою спектрофотометрії оптичну щільність вимірюють при λ = 260 нм (OD260), максимумі поглинання нуклеїнових кислот (ДНК, РНК) та при λ = 280 нм (OD280), максимумі поглинання білків. Чи забруднена проба геномною ДНК або білками, можна визначити з коефіцієнта OD260 та OD280. Для чистої РНК коефіцієнт повинен бути приблизно 2,0. Якщо значення нижче цього, зразок забруднений білком, геномною ДНК та/або ароматичними речовинами. У цьому випадку РНК слід очистити ще раз. Оскільки OD260 1 відповідає 40 мкг/мл РНК, концентрацію РНК можна розрахувати за такою формулою:
Концентрація [мкг/мл] = OD260 × 40 мкг/мл × коефіцієнт розведення