Виявлення сироватки d-специфічного IgE; алергени - Swiss Medical Review
резюме
Клінічний контекст визначає декілька способів використання конкретних методів виявлення IgE. У контексті медицини первинної медичної допомоги швидкі аналізи, які можна провести близько до пацієнта, мають місце як альтернатива шкірним пробам. Для звичайної практики в кабінеті лікаря кращі кількісні методи скринінгу атопії (фадіатоп або еквівалентні). Їх негативне прогнозне значення корисне для виключення атопії. Крім того, розрізнити сезонну та багаторічну алергію легко.
Для спеціалістів кількісні результати специфічного IgE можуть бути пов'язані з ймовірністю клінічної реакції на алерген. Клінічні пункти прийняття рішення були встановлені для кількох поширених харчових алергенів, пов'язаних з атопічною екземою у дітей.
Вступ
Діагностичний алгоритм для підтвердження IgE-опосередкованої алергії починається з анамнезу та спостереження за ураженням органу-мішені захворюванням. Пов’язаність симптомів алергії з впливом зовнішніх факторів (наприклад, пилку, шерсті котів) підсилює припущення про причинність. Сенсибілізація до підозр на алергени підтверджується шляхом шкірного тестування in vivo або тестування сироватки на наявність специфічного для алергену IgE. Однак різні алергенспецифічні методи виявлення IgE не мають однакових характеристик.
Шкірний тест «Укол» є загальновизнаним стандартом для демонстрації негайних реакцій гіперчутливості, пов’язаних із загальним алергеном. Завдяки швидко доступним результатам, шкірний тест є інструментом вибору алерголога. Причинно-наслідковий зв'язок між симптомами та підозрою на алерген може бути встановлений більш формально за допомогою провокаційних тестів, якщо це необхідно.
Визнані показання для сироваткового виявлення специфічного IgE узагальнені в таблиці 1. 1. Ці методи in vitro мають багато переваг: точна кількісна оцінка, абсолютна безпека, відсутність втручання лікарських засобів та можливість зберігання зразків для подальших аналізів. Для пошуку цих специфічних антитіл можна використовувати багато технологій, але їх властивості відрізняються.
Методи виявлення специфічних алергенів IgE
Ще в 1967 р. Техніка радіоімунологічного аналізу (RIA) дозволила ідентифікувати "реагін" як специфічний IgE для алергенів. 2 Моноклональний IgE людини, очищений від мієломи IgE, використовували для отримання поліклональних антитіл, специфічних для важкої ланцюга e. У початковому методі клінічного використання (PhadebasRAST) алергени фіксували на активованих целюлозних дисках і дозволяли напівкількісне вираження результатів на основі калібрувальної кривої, встановленої із специфічним IgE пилку берези. Відносну кількість сироваткового IgE, зв’язаного з алергеном, інтерполювали на основі інтенсивності зв’язування анти-IgE. Створена шестикласна напівкількісна система підрахунку балів, яка використовується і сьогодні. Однак від його використання слід відмовитись на користь кількісних значень в КІЕ/л. 3
Поступове вдосконалення різних методологічних аспектів призвело до сучасних еталонних методів, які є кількісними, відкаліброваними за тим самим міжнародним стандартом 4 та найчастіше автоматизованими.
Основні технічні розробки такі.
Алергени та зв'язування з опорою
Застосування алергенів у твердій фазі (алергосорбент) або у рідкій фазі надає різні властивості зв'язування IgE з точки зору специфічності та спорідненості. Можливість роботи з надлишком алергенів зводить ці ефекти до мінімуму, ось чому здатність зв’язування алергенів на підставці стала визначальною для забезпечення належної чутливості цих методів. Одним з головних досягнень є розробка полімеру, інкапсульованого в гідрофобну матрицю, що дозволяє ковалентно зв’язувати велику кількість алергенів. Цей полімер, званий системою Pharmacia CAP, покращив чутливість і специфічність виявлення специфічного IgE. Численні клінічні дослідження, проведені в тих самих умовах, роблять його еталонним методом сьогодні.
Починаючи з різних технічних властивостей, інші методи мали паралельний розвиток. Корпорація діагностичних продуктів (DPC) вирішила працювати у розчинній фазі з алергенами, міченими біотином. Реакція алерген/IgE на антитіла в сироватці крові пацієнта протікає у рідкій фазі, а потім іммобілізується на опорі, що складається з гранул, покритих стрептавідином. Узгодженість результатів, отриманих цією методикою (Імуліт) у порівнянні з UNICAP, є прийнятною. Наприклад, це> 80% для виявлення специфічного IgE щодо харчових продуктів. 2
Однак стандартизація алергенів та порівняння з клінічними даними досягнуто лише частково. Дійсно, складна природа алергенних екстрактів становить головну проблему для оптимізації методів виявлення специфічних IgE-алергенів. Визначення основних алергенів серед груп пацієнтів з алергією іноді займає роки. Крім того, ці алергени можуть різнитися в різних країнах, зокрема. Властивості кожного рекомбінантного алергену слід порівнювати індивідуально з природними алергенами у хворих на алергію, як це було для арахісу. 6 Ця копітка робота триває для багатьох алергенів.
Удосконалення методів виявлення специфічного IgE для латексу є недавньою ілюстрацією внеску та значення рекомбінантних алергенів для клінічної діагностики. Дійсно, основним алергеном природного латексу, Hevea brasiliensis 5 (Hev b5) є кислий білок, лабільний та модифікований під час екстракції та фіксації на опорі матриці. 7 Додавання рекомбінантного білка Hev b5 до природного екстракту, зафіксованого (додавання) на матрицю, дозволило посилити чутливість на 10% без зменшення специфічності. Клінічне використання специфічного IgE проти рекомбінантних білків пилку також має великі перспективи для кращого прогнозування відповіді на лікування імунотерапією.
Друга лінія розвитку передбачає фіксацію індивідуалізованих алергенів на тій самій опорі, тоді сигнал кількісно визначається та екстраполюється в напівкількісні результати для кожного з алергенів. Ці методи використовуються для аналізу на смужках. Вони представляють труднощі у стандартизації та відтворюваності певних алергенів.
Зовсім недавно мікросхеми мікрочипів дозволили розробляти нові методи з використанням плям алергенних білків, пов'язаних з активованою матрицею кремнезему. 9 Застосування мінімальної кількості білка (наприклад, 10 нл/пляма) у цій робототехнічній техніці теоретично дозволяє виявити специфічний IgE щодо безлічі окремих білків, використовуючи мало сироватки. Кількісне визначення сигналу різних плям проводиться за допомогою спектрофлуорометрії. Сучасні результати таких методів мають недоліки, які не виправдовують клінічного використання на даний момент.
Калібрування та кількісна оцінка
Калібрування та кількісне вираження результатів ставили методологічні проблеми. Спочатку інтенсивність зв’язування IgE, специфічного для сироватки крові, що відноситься до стандартної кривої, виконаної з приготуванням специфічного для берези IgE у п’яти концентраціях, виражалася у довільних одиницях (PRU/мл; Phadebas RAST). Напівкількісні інтервали інтенсивності були визначені в чотирьох класах. Аналітична чутливість варіювалась залежно від алергенів; конкурентне інгібування IgG було обмеженим фактором, наприклад, у пацієнтів з високим ступенем впливу, таких як бджолярі. Деякі з цих проблем були вирішені завдяки впровадженню системи Pharmacia CAP на початку 1990-х рр. Дійсно, використання стандарту ВООЗ (IRP 70/702) для IgE людини дозволило розробити надійну стандартну криву в кожному ряди та кількісне вираження результатів у кІЕ/л. 3 Криві розведення, паралельні стандартній кривій, проводили для кожного алергену. Ця суттєва робота зі стандартизації дозволила перевірити методологію кожного алергену та виразити справді кількісні результати (Таблиця 2).
Автоматизація
Подальше поліпшення відтворюваності результатів пов'язане з автоматизацією методів виявлення. Отримана точність помітна для вираження кількісних результатів. 10 Зокрема, останні дозволяють встановити позитивні та негативні значення клінічної ймовірності.
Вираження результатів та забезпечення якості
Кількісні та автоматизовані методи відрізняються кількома особливостями напівкількісних методів (табл. 3). Кількісні результати виражаються в міжнародних одиницях (кМЕ/л) і посилаються на стандарт, що використовується для калібрувальної кривої. За відсутності міжнародного стандарту для специфічного IgE стандартом є препарат IgE ВООЗ 75/702 (1 МО = 2,4 нг IgE).
Варіабельність алергічного захворювання та численні заважаючі фактори (перехресні алергії, фіксовані алергени.) Повинні заохочувати лабораторії та лікарів застосовувати лише кількісні методи для підтвердження конкретної сенсибілізації або встановлення значення. Клінічна ймовірність.
Режим вираження результатів у класі RAST (від 1 до 6), хоча він може сприяти клінічній інтерпретації, не є важливим для кількісних аналізів. Однак це дозволяє послідовно виразити результати напівкількісних методів та порівняти різні методи між ними, зокрема в тестах на кваліфікацію.
Забезпечення якості методів виявлення специфічних алергенів IgE повинно бути суворим з огляду на труднощі стандартизації та відсутність міжнародного стандарту для специфічного IgE. Частина виробника включає перевірку всіх аспектів виробництва та відтворюваності реагентів.
Завдяки загальному контролю ефективності ми можемо назавжди забезпечити придатність методів, що використовуються для клінічного використання. Зазвичай ми відрізняємо внутрішній контроль (з відомим цільовим значенням), що вводиться в кожній серії аналізів, від зовнішнього контролю за працездатністю (з невідомим цільовим значенням), що надсилається кілька разів на рік організованим центром якості.
Внутрішній контроль роботи кожної серії відповідає лабораторія або лікар, який проводить аналізи. Зразок внутрішнього контролю повинен бути незалежним від калібрування та його показників, виражених проти встановленої цілі. Після декількох серій можна розрахувати коефіцієнт варіації методу.
Зовнішній моніторинг конкретного IgE спочатку був ініційований виробником як підтримка можливостей для споживачів. Надійність і відтворюваність їх методу демонструвались протягом кількох років з коефіцієнтом варіації близько 10%. В даний час незалежні центри пропонують міжлабораторні перевірки кваліфікації, що дозволяють акредитувати ці методи.
У Швейцарії, в рамках LAMal та його рецептів, був організований зовнішній контроль якості послуг медичної лабораторії та базової допомоги. Швейцарський центр контролю якості за допомогою Швейцарського товариства алергії та імунології пропонує контроль якості у цій галузі. Три загальні алергени, які є представниками діагностичного класу (пилок берези, котячий епітелій, арахіс) та суміш для виявлення атопії пропонуються як зовнішній контроль з 2003 року. Інші європейські центри якості пропонують тести на незалежну придатність для множинних специфічних IgE. Вони доступні для медичних лабораторій, але непропорційні для лабораторії практикуючого.
Зовнішній контроль якості загального та специфічного IgE є юридичним зобов'язанням з 2004 року отримувати відшкодування цих послуг з боку медичної каси. Результати цих перевірок показують адекватність запропонованих методів виявлення специфічних IgE (з допуском, дозволеним Qualab, класу RAST).
Інтерпретація результатів
Корисність скринінгових тестів на атопію або групу алергенів
Виявлення специфічного IgE проти кількох алергенів, зафіксованих на одній опорі, дозволяє оцінити сенсибілізацію до набору алергенів. Атопію або респіраторну алергію виявляють Phadiatop (суміш респіраторних алергенів), Sx1 (суміш, що містить флеол, жито, березу, полин, кліщі, лупу котів та собак, Cladosporium herbarum), Alatop (суміш алергенів для респіраторних CPD) або еквівалент.
Результат цих тестів зазвичай представляється як позитивний/негативний. Особливістю Phadiatop є хороша негативна прогнозована цінність. Тому його корисність полягає у виключенні атопії у пацієнтів з низькою ймовірністю розвитку атопічного захворювання. Кілька досліджень підтвердили відповідність цих результатів аналізу результатам шкірних тестів у великих когортних дослідженнях, таких як Sapaldia (приблизно 25% сенсибілізованих дорослих) або Scarpol (приблизно 35% сенсибілізованих дітей).
Зовсім недавно була встановлена кореляція між кількісними результатами Phadiatop та ймовірністю атопічного захворювання. У контексті надання першої допомоги у дітей корисність скринінгу атопії (Phadiatop + fx5) виявилася визначальною для практикуючого. 11
Багато груп відомих алергенів були зібрані для досягнення сенсибілізації до сімейства алергенів, що відповідає набору клінічного значення. Більш загальні групи включають алергени, важливі для скринінгу на сезонну алергію (Rx1) або багаторічну алергію (Rx2). 12 Група fx5 дозволяє виявити часті харчові алергії у маленьких дітей (молоко, яйце, пшениця, арахіс, соя).
Розроблена номенклатура груп алергенів, що описує різні суміші: трави (gx), трав'янисті (wx), дерева (tx), цвілі (mx), тварини (ex), їжа (fx) серед інших. Результати специфічного IgE проти цих груп алергенів відомого складу є кількісними, але не пов'язаними з кількістю алергенів. Ці тести часто призначають з метою сенсибілізації до сімейства алергенів без можливості одночасного виявлення порушуючого алергену. У клініці слід зіткнутися з негативними результатами, знаючи алергени, що входять до складу суміші, та інші елементи аллергологічного алгоритму діагностики. Якість цих тестів та їх співвідношення з клінікою є задовільними, але різняться залежно від техніки та розглянутих груп алергенів.
Швидкі методи специфічного виявлення IgE
Це найчастіше методи виявлення, при яких алергени фіксуються (окремо або групами) на нітроцелюлозній мембрані, інкубуються з сироваткою пацієнта, а потім виявляються за допомогою простої ферментативної системи виявлення. Ці методи виявлення підтверджені як скринінг на атопію, групи алергенів або даний алерген.
Однак завдяки їх калібруванню ці методи виявлення дозволяють виражати напівкількісні результати, які зазвичай екстраполюються, у класі RAST. Їх слід робити біля пацієнта, як альтернативний метод шкірних проб, коли це неможливо.
Інтерпретація конкретних кількісних результатів IgE
Удосконалення кількісних методик для виявлення специфічного IgE дозволило підтвердити чутливість і клінічну специфічність понад 90% для великої кількості алергенів.
Інтерпретація результатів та їх клінічна інтеграція були розроблені кількома шляхами. По-перше, визначення ідеального порогового значення може бути встановлене в даній популяції для найбільш важливих алергенів шляхом статистичного аналізу реципієнта-оператора або кривої ROC. 13 Складності, пов'язані з цим підходом, включають знання поширеності та варіації порогу для кожного алергену. Подібним чином цей тип статистичного аналізу використовувався для дисоціації сенсибілізованих пацієнтів із симптомами або без них. 14 Практичний обсяг цих досліджень поки що залишається обмеженим.
Висновок
Розробка кількісних методик для виявлення специфічного IgE дозволила встановити взаємозв'язок між значеннями кількісних результатів та ймовірністю клінічної реакції на алерген. Ці позитивні/негативні значення клінічної ймовірності, засновані на кількісній методології, встановленій в одній системі вимірювання, не застосовуватимуться в інших системах без перевірки. Кількісні методи виявлення конкретного IgE краще відповідають потребам фахівців у підтвердженні. Кількісні результати допомагають направляти лікування та уникати складних діагностичних процедур.
Різниця між різними типами специфічних методів виявлення IgE передбачає конкретне клінічне використання для кожного. У контексті первинної медицини методи, які за короткий час дають результат, мають місце як альтернатива шкірним пробам. Їх результати дозволяють здійснювати цілеспрямоване лікування. Скринінгові тести на атопію продемонстрували свою корисність у підході лікаря, зокрема, щодо їх негативного прогнозування.