Вимірювання базального та форсколін-стимульованого ліполізу в протоці пахових жирових жирових прокладки

Резюме

Цей протокол описує метод визначення базального та стимульованого форсколіном ліполізу в пахових жирових прокладках, отриманих із звичайної дієти чау (НЧД) або дієти з високим вмістом жиру (HFD) ± мишей дикого типу, харчуваних капсаїцином Вивільнення гліцерину з пахових жирових прокладок вимірювали як показник ліполізу.

форсколін-стимульованого

Анотація

Ліполіз - це процес, при якому ліпід, що зберігається у вигляді тригліцеридів у жировій тканині, гідролізується в гліцерин та жирні кислоти. У цій статті описується метод вимірювання базального та форсколінового (FSK) стимульованого ліполізу в пахових жирових прокладках, виділених від мишей дикого типу на нормальній дієті чау (НЧД), дієті з високим вмістом жиру (ХФД) або дієті з високим вмістом жиру з 0 01% дез капсаїцину (CAP; агоніст ванілоїдного підсімейства 1 (TRPV1) перехідного потенціалу рецептора) годували протягом 32 тижнів. Описаний тут метод для проведення ex vivo ліполізу використовується Schweiger et al. 1 Ми представляємо детальний протокол вимірювання рівня гліцерину за допомогою спектрофотометрії, що бачить ультрафіолетовий промінь (UV/VIS). Метод, описаний тут, може бути використаний для успішного виділення пахових жирових прокладок для вимірювання ліполізу для отримання незмінних результатів. Протокол, описаний для пахових жирових прокладок, можна легко розширити для вимірювання ліполізу в інших тканинах.

Вступ

Жирові тканини накопичують енергію, оскільки для термогенезу 3, 4 необхідне окислення жирних кислот. Жирні кислоти, які вживаються під час дієти, упаковуються в хіломікрони разом з апопротеїнами і через кров потрапляють у різні тканини організму. Хоча більшість клітин тіла зберігає запас енергії, жирова тканина зберігає надлишок енергії як жир 5, 6. Ліполіз в жировій тканині регулюється складними процесами, і молекулярні деталі ліполізу все ще залишаються розмитими 7 .

Ліполіз - це процес, при якому тригліцериди (TGL), що зберігаються в жировій тканині, гідролізуються з утворенням гліцерину та жирних кислот (FA) ферментом адипозною тригліцеридом ліпазою (ATGL) 8. Зміни базального та стимульованого ліполізу є характерною особливістю ожиріння. Липоліз асалів регулюється активацією ATGL 9, яка перетворює TGL в діацилгліцерин (DAG), який потім гідролізується до моноацилгліцерину (MAG). Активація гормоночутливої ​​ліпази (HSL) через аденилілциклазу активує циклічну стимуляцію аденозинмонофосфату (цАМФ) протеїнкіназою А (РКА) та спричинює ліполіз. Тому вимірювання базового та стимульованого ліполізу є важливим для аналізу активності білків, що беруть участь у цьому процесі. Розшифровка молекулярної регуляції ліполізу також може бути корисною при розробці нових терапевтичних стратегій проти ожиріння 10. Оскільки молекули, що стимулюють ліполіз та окислення жирних кислот, є потенційними кандидатами для зменшення жирів, що зберігаються в депо, важливо використовувати надійний тест на відтворюваність.

Опубліковані на сьогодні дані дозволяють припустити, що активація білка TRPV1, вираженого в білій жировій тканині, за допомогою CAP та FSK (активатор аденилілциклази) - стимулював ліполіз в пахових жирових прокладках 11. На сьогоднішній день дослідження також свідчать про те, що тривала активація TRPV1 за допомогою CAP активує PKA12. Оскільки активація PKA стимулює ліполіз 13, 14, як базальний, так і PKA-залежний стимульований ліполіз в пахових жирових прокладках, які після 32 тижнів годування відповідними дієтами NCD або HFD (± CAP) -Fed- Мишей виділяли для підтвердження ролі активації TRPV1 у ліполізі

У цій статті описаний ефективний метод визначення базального та стимульованого ліполізу. Хоча доступні й інші методи, що забезпечують радіоактивні ізотопи гліцерину та нудну високоефективну рідинну хроматографію або газову хроматографію/мас-спектрометрію для вимірювань 15, 16, цей метод забезпечує просту, просту та недорогу методику визначення ліполізу в жировій тканині.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі протоколи відповідають вимогам Університету Вайомінгу щодо захисту тварин.

1. Тваринництво та годівля тварин

ПРИМІТКА: Дорослі особини мишей дикого типу (C57BL/6) (віком від 12 до 24 тижнів) були виведені в дослідницькій установі згідно з протоколами, затвердженими Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC).

  1. Починаючи з 6-го віку, домашніх мишей в групах по чотири в окремих клітках і випадковим чином розподіляють до груп, що годують НИЗ або HFD (± 0,01% CAP) до 38-го тижня.
    ПРИМІТКА: CAP є агоністом білка каналу TRPV1, що експресується в жировій тканині 11, 17. Змішайте CAP з HFD у блендері у витяжці та перекладіть змішану суміш на лоток із невеликими розділювачами 1 на 2. Зберігайте лоток у морозильній камері до -20 ° C. Вийміть піддон з дієтою HFD + CAP з морозильної камери через 24 години і зберігайте у контейнері при морозильній камері при -20 ° C до використання.
  2. Домашні миші розміщуються в кондиціонованому середовищі (22,8 ± 2,0 ° C, вологість 45-50%) з циклом 12/12 світло/темно з доступом до призначеної дієти та води за бажанням .
  3. Наприкінці 38 тижнів виділяють адинозну жирову тканину та використовують для експериментів ліполізу (розділи 2-7).

2. Підготуйте мишей до експериментів

  1. Знеболіть мишей, вводячи суміш кетаміну та ксилазину (10 мг/кг та 80 мг/кг маси тіла відповідно). Ін'єкція 0,01 мл суміші/10 г маси тіла миші.
  2. Підтвердіть глибоку анестезію твердим пальцем пальця. Якщо є рефлекс на педаль, протестуйте мишу ще раз принаймні через 30 секунд.
  3. Використовуйте ветеринарні препарати для запобігання сухості очей під час наркозу. Не залишайте мишей без нагляду під час будь-якої з процедур.
  4. Евтаназувати мишей шляхом ін’єкції високої дози кетаміну та ксилазину в суміші (10 мг/кг та 80 мг/кг маси тіла відповідно) E (0,01 мл/10 г маси тіла) з подальшим вивихом шийки матки.
    ПРИМІТКА: Цей метод евтаназії схвалений Університетом Вайомінгу IACUC.

3. Виділення пахових жирових прокладок

15 хв).

  • Ізолюйте жирові подушечки з правого боку миші, як описано в кроках 3.2-3.6.

    • 4. Вивільнення базального гліцерину з пахових жирових прокладок

    5. ФСК-стимульований ліполіз

    6. Приготування вільного гліцеринового реагенту

    1. Розведіть гліцериновий реагент 19 у 40 мл деіонізованої води у флаконі з бурштинового скла, поставте на нього пробку та перемішайте 10 разів. Не змішуйте струшуванням.
    2. Зберігайте флакон при температурі 4 ° C у холодильнику подалі від світла, повністю закривши флакон алюмінієвою фольгою.
    3. Продовжуйте готувати стандарт гліцерину (розділ 7).

    7. Приготування стандарту гліцерину та визначення вмісту гліцерину

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Ліполіз
    (Нмоль гліцерину/мг білка/год)         		НИЗ
    (N = 6)         		HFD
    (N = 6)         		HFD + CAP
    (N = 6)
    Базальний 16,22 ± 1,28 17,16 ± 1,48 52,07 ± 2,66
    ФСК стимулює
    (З триацином С)    		 54,88 ± 3,27 41,23 ± 4,43 72,04 ± 4,16

    Таблиця 1: Вплив CAP на базальний та FSK-стимульований ліполіз у пахових жирових прокладках. Середнє базальне і FSK-стимульоване вивільнення гліцерину ± SEM, виміряне в паховій жировій тканині, отримане від мишей дикого типу, що харчуються NCD-, HFD- або HFD + CAP.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Процес розкладання TGL до гліцерину та жирних кислот каталізується ATGL 9 під час базального ліполізу і організовується низкою білків, включаючи активацію аденілілциклази/PKA-залежного шляху під час стимульованого ліполізу 21, 22, 23. Посилення ліполізу збільшує рівень жирних кислот у плазмі для транспортування та витрат енергії 24. Жирні кислоти поглинаються мітохондріями у вигляді ацетил-КоА, який використовується для отримання енергії.

    У цій статті описаний метод вимірювання вивільнення гліцерину з білої жирової тканини. Хоча доступно кілька методів зі стабільними ізотопами гліцерину, для вимірювання 15, 16 вони вимагають або високоефективної рідинної хроматографії, або газової хроматографії/мас-спектрометрії. Вимірювання радіо-індикатора гліцерину також пов'язане з неспецифічністю 31. Альтернативні методи включають визначення рівня мРНК та білків ліпаз та регуляторних білків, що беруть участь у ліполізі. Колориметричні методи також доступні для дати концентрації довголанцюгових жирних кислот в циркуляції. Описаний тут метод є дуже ефективним для аналізу вивільнення гліцерину з жирових тканин, як це можна зробити за допомогою планшетного зчитувача, здатного вимірювати флуоресценцію та поглинання. Спрощений аналітичний метод вивільнення гліцерину, описаний у цій статті, також забезпечує покращену стабільність та точність 32 .

    Слід застосовувати стандартні операційні процедури, оскільки цей метод включає хірургічні методи для виділення жирових відкладень. Цей протокол рекомендує використовувати знежирений BSA. Це може призвести до утворення бульбашок повітря, які впливатимуть на вимірювання поглинання. Тому важливо забезпечити обробку зразків, щоб уникнути появи бульбашок повітря. Слід бути обережним, щоб не струшувати і не перевертати зразки під час лікування БСА, якщо такий етап не рекомендований у протоколі. Крім того, етап вилучення жиру з пахового жиру є критичним, оскільки наявність жиру заважає визначенню білка пахової жирової тканини Н Крім того, готуючи стандарти гліцерину, важливо змішувати вміст інверсією і не струшувати флакон.

    Описана тут процедура може бути використана для успішного виділення пахових жирових прокладок для кількох аналізів, включаючи вимірювання ліполізу. Протокол ліполізу, описаний для пахових жирових прокладок, можна легко розширити для вимірювання ліполізу в інших тканинах. Методи оптимізовані для всіх типів жирових прокладок та преадипоцитів.

    Підсумовуючи, ця стаття описує метод вимірювання базального та стимульованого ФСК вивільнення гліцерину в пахових жирних кислотах, виділених від мишей, хворих на NCD або HFD (± CAP). Представлені дані свідчать про те, що активація TRPV1 за допомогою CAP збільшувала базальний і стимульований FSK ліполіз та запобігала накопиченню ліпідів у жировій тканині. Ці дані показують вирішальну роль білка TRPV1 у регуляції ліполізу в білій жировій тканині

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.