Вимірювання фізіологічних стресових реакцій в С

Резюме

Тут ми характеризуємо клітинні протеотоксичні стресові реакції на нематоду C. elegans шляхом вимірювання активації флуоресцентних репортерів транскрипції та спостереження чутливості до фізіологічного стресу.

Анотація

Вступ

Багато знань про регуляцію та активність реакцій клітинного стресу приписується нематоді Caenorhabditis elegans, багатоклітинному модельному організму в генетичних дослідженнях. Нематоди дають можливість вивчати не тільки активацію стресових реакцій на клітинному рівні, але і на рівні організму; Нематоди використовувались для вивчення впливу генетичних порушень або впливу наркотиків та забруднюючих речовин на їх ріст та виживання. Їх швидкий час генерації, ізогенність, прозорість, здатність до генетичної тяги та простота використання під час експериментів роблять їх ідеальними для таких досліджень. Крім того, відносно швидка фізіологічна реакція на стрес (між годинами та кількома днями) та еволюційне збереження клітинних шляхів роблять нематоди чудовим інструментом у вивченні стресостійкості.

На додаток до репортерського аналізу, чутливість або стійкість тварин до стресу можна виміряти за допомогою фізіологічних стрес-тестів. Це досягається шляхом впливу на тварин стресового середовища, яке активує певні клітинні шляхи стресу. Тут пропонуються різні методи вимірювання чутливості цілих тварин до певних типів стресових факторів.

ER-стрес застосовується до C. elegans за допомогою хімічного агента тунікаміцину, який блокує N-зв’язане глікозилювання та викликає накопичення неправильно складених білків у ER 10. У C. elegans ріст призводить до значних порушень функції ER та значно скорочує тривалість життя під впливом тунікаміцину 11. Шляхом вимірювання виживання тварин на пластинах, що містять тунікаміцин, можна оцінити кількісну оцінку чутливості до напруги ЕР тварин. Наприклад, тварини з ектопічною індукцією UPR-ER і, таким чином, підвищеною стійкістю до стресу, що спричиняє неправильне згортання білка, мають підвищену виживаність після впливу тунікаміцину порівняно з дикими тваринами 12. ВІН

Окислювальний та мітохондріальний стрес застосовується до C. elegans, піддаючи тварин впливу хімічного агента паракват. Паракват - це часто вживаний гербіцид, який викликає утворення супероксиду, особливо в мітохондріях 13. Через специфічну локалізацію реактивних форм кисню, отриманих мітохондріями (АФК), аналізи параквату часто використовуються як "мітохондріальний" стрес-тест. Однак супероксид швидко перетворюється на пероксид водню за допомогою мітохондріальних супероксиддисмутаз (СОД) 14. Потім перекис водню може дифундувати з мітохондрій і спричинити окислювальний стрес в інших частинах клітини. Тому ми описуємо аналізи виживання параквата як міру чутливості як до мітохондріального, так і до окисного стресу (інші аналізи окисного стресу див. 15).

Тести на термічну сумісність проводять у C. elegans, поміщаючи тварин у підвищені температури. Температура навколишнього середовища для нематод становить 15-20 ° C, а температурний стрес викликається при температурах вище 25 ° C 16, 17. Тести на теплову сумісність зазвичай проводять при температурах 30-37 ° C, оскільки тварини мають великі клітинні дефекти при цій температурі, а випробування на виживання проводяться протягом 24 годин 16, 18. Тут проводяться два альтернативні методи при проведенні аналізів термотолерантності: ріст при 34 ° C та ріст при 37 ° C. Разом представлені тут протоколи можна використовувати для проведення широкомасштабних скринінгів у поєднанні зі стандартним нокдауном генів із втручанням РНК або бібліотеками хімічних препаратів.

Протокол можна розділити на 4 загальні процедури - ріст C. elegans та підготовка до візуалізації (розділи 1 та 2), візуалізація репортерів транскрипції за допомогою флуоресцентної мікроскопії (розділи 3-5), кількісні вимірювання репортерів із використанням великого потоку частинок - Цитометр (розділ 6) та фізіологічні голки для вимірювання чутливості до стресу у C. elegans (розділ 7).

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Стандартні умови вирощування температур & OP50 проти HT115

2. Постановка/синхронізація глистів шляхом відбілювання

5. Візуалізація за допомогою стереомікроскопа або широкопольного/складеного мікроскопа з малим збільшенням

6. Кількісні вимірювання від репортерів з великим цитометром потоку частинок

ПРИМІТКА: Зростання та підготовка хробаків до аналізу повнометражного цитометра з великими частинками може дотримуватися тих самих парадигм, що і розділи 1-5 для підготовки хробаків до флуоресцентної візуалізації, за винятком того, що потрібна більша кількість тварин . Використовуйте> 500 тварин за умовою, оскільки деякі тварини будуть втрачені під час маніпуляцій, не всі тварини відповідають критеріям фільтра під час кількісного визначення, а деякі тварини не будуть правильно зчитуватися проточним цитометром. Промити тварин для сортування пластин у 5-10 мл розчину М9 у конічних пробірках об'ємом 15 мл для подальшого сортування на проточному цитометрі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Використання транскрипційних репортерів для вимірювання активації стресових реакцій
Тут використовують флуоресцентні репортери транскрипції, які служать надійними інструментами для вимірювання активації більшості реакцій на стрес у C. elegans. Вираз GFP керується за підтримки канонічних цілей головними регуляторами транскрипції, що беруть участь у реагуванні на специфічні для суб'єкта стреси. Вичерпний перелік часто використовуваних репортерів транскрипції див Таблиця 3.

Фізіологічні аналізи для вимірювання сприйнятливості до стресу у C. elegans
C. elegans - чудовий модельний організм для вимірювання чутливості до стресу завдяки низькій вартості технічного обслуговування та експериментів та простоті редагування геному або генетичного нокдауну з RNAi, що забезпечує можливість проведення широкомасштабних експериментів у цілому організмі. Для оцінки толерантності до стресу до стресу ER ми піддали C. elegans дії хімічної речовини тунікаміцин, яка спричинює накопичення пошкоджених білків у ER, блокуючи N-зв’язане глікозилювання 10. Тварини піддаються дії тунікаміцину після розвитку, оскільки препарат викликає вади розвитку. При дії тунікаміцину у дорослих глистів помітно зменшується тривалість життя. Крім того, нокдаун гена xbp-1, який кодує один з первинних факторів транскрипції, що бере участь в індукції УПР ER, призводить до значного збільшення чутливості до тунікаміцину (рис.5).А.) 12. Таким чином, це служить надійним тестом для вимірювання чутливості до напруги у дорослих глистів.

Для вимірювання окисного стресу та мітохондріального стресу ми піддаємо тварин хімічній сполуці паракват. Паракват спричиняє мітохондріальний стрес, синтезуючи АФК у матриксі мітохондрій, який потім може перетворюватися на перекис водню та дифундувати з мітохондрій, викликаючи окислювальну шкоду цілих клітин 13. Подібно до аналізів стресу при ER, ми піддаємо тварин параквату в зрілому віці. Однак ми проводимо рідкі аналізи параквату для зменшення вартості та ручної праці, а аналізи на основі агарових пластин були б складними для більшості лабораторій. Тут ми показуємо, що тварини, що зазнали впливу параквату в рідкій рідині, мають середню виживаність близько 5 годин (рисунок 5B.). Крім того, нокдаун рецептора інсуліну daf-2 призводить до підвищеної стійкості до параквату, оскільки активація DAF-16/FOXO призводить до підвищеної експресії видів, що беруть участь у кліренсі АФК, наприклад Б. Сод-3 42, 43. Тести на виживання параквата короткі, тривають до 14 годин, і тому служать ефективним методом для опитування мітохондріальних та окисних реакцій на стрес.

Таблиця 3: Репортер транскрипції для оцінки активації реакцій клітинного стресу. Всі перелічені тут штами доступні за допомогою CGC або за допомогою спеціальних лабораторних запитів для використання в якісних та кількісних процедурах візуалізації, описаних у цьому рукописі. Всі ці штами є похідними з фона Bristol N2. Також пропонуються рекомендовані методи застосування стресу для активізації репортерів. Усі репортери, за винятком копалини-3р: GFP 45 та T24B8.5p: GFP 46, описані в тексті.

Трансгенний	Рекомендоване застосування (и) натягу	Час витримки за допомогою стереомікроскопа Leica M2250FA	Час витримки за допомогою мікроскопа Revolve ECHO	Значення PMT з органічним сортувачем Union Biometrica COPAS
hsp-4p: GFP	25 г/мл тунікаміцину (приблизно 4 години з нічним відновленням)	200 мс	275 мс	450
hsp-6p: GFP	3 М антиміцин А (близько 16 годин);	100 мс	50 мс	350
	RNAi проти ETC або мітохондріальної рибосоми (з люка)
hsp-60p: GFP	3 М антиміцин А (близько 16 годин);	200 мс	100 мс	450
	RNAi проти ETC або мітохондріальної рибосоми (з люка)
hsp-16.2p: GFP	34 ° C 2 години	400 мс	200 мс	500
hsp-70p: GFP	34 ° C 2 години	400 мс	300 мс	500
gst-4p: GFP	50 мМ паракват (приблизно 2 години);	100 мс	50 мс	350
	2 мМ трет-бутил гідропероксиду (приблизно 4 години з нічним відновленням)
дерново-3р: GFP	RNAi проти Daf-2 (рецептор інсуліну)	300 мс	300 мс	475
T24B8.5p: GFP	Вплив збудника (наприклад, P. aeruginosa)	100 мс	50 мс	350

Таблиця 4: Рекомендовані параметри для флуоресцентної мікроскопії та кількісного визначення за допомогою біосортера з великими частинками. Ця таблиця призначена як орієнтир для рекомендованого часу експозиції для флуоресцентної мікроскопії або значень ПМТ для біосортера великих частинок. Вони служать хорошими вихідними точками, але час експозиції та значення PMT слід регулювати для кожного експерименту, щоб переконатись, що не відбувається насичення і що значення флуоресценції перевищують межу виявлення фонового сигналу. Якщо зразок з найяскравішим сигналом відомий для експерименту (наприклад, позитивні контролі для індукції напруги), ці зразки можуть бути використані для визначення найвищого часу експозиції або ФМТ, який можна використовувати без сигналу насичення. Якщо найяскравіші зразки невідомі, можна використовувати контролер і використовувати час експозиції або ФМТ в середині динамічного діапазону вашої системи.

Таблиця 6: Рекомендовані генні мішені та пари праймерів для вимірювання транскрипційного підвищення регуляції генів стресової реакції.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Іншим обмеженням описаних методів є те, що зображення та кількісне визначення біосортером мають обмежену пропускну здатність. Хоча кількісне визначення біосорторів у 96-лункових планшетах може бути зроблено для більшої пропускної здатності, воно все ще обмежене необхідністю перенесення хробаків у розчин, тоді як візуалізація обмежена здатністю експерта проводити підготовку хробаків та проводити мікроскопію обмежено. Отже, великі екрани, швидше за все, включатимуть лише візуальний показ сигналу флуоресцентного репортера, причому лише попадання будуть відображені та кількісно оцінені.

Всі методи, описані тут, можуть бути використані самостійно або в поєднанні для всебічного аналізу генів або лікарських засобів, що представляють інтерес, та їх впливу на реакцію на стрес. Широкоформатні екрани можна запускати з використанням аналізів репортерів з високою пропускною здатністю, а вторинні екрани - з кількісним аналізом цих репортерів. Як тільки списки генів/препаратів, що піддаються управлінню, знову визначаються, можуть бути проведені фізіологічні тести для виявлення кандидатів, які мають прямий вплив на загальну фізіологію тварин. Інші методи, запропоновані вище, також можуть бути використані для перевірки або подальшого дослідження.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

---