Вплив холестерину на рухливість зовнішніх волоскових клітин вушної раковини морської свинки
Вплив холестерину на рухливість зовнішніх волоскових клітин вушної раковини морської свинки та на моторний білок престін Йоханнеса Майкла Шміда
З клініки та поліклініки вуха, носа та горла в Університеті Людвіга Максиміліана в Мюнхені Директор: проф. мед. Олександр Берггаус Вплив холестерину на рухливість зовнішніх клітин волосся морської свинки і на моторно-білковий престин Дисертація на здобуття докторської ступеня медицини на медичному факультеті Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені, представлена Йоганнесом Майклом Шмідом з Мюнхена в 2011 році
З дозволу медичного факультету Університету Мюнхена Доповідач: Співдоповідач: Priv.-Doz. Лікар. мед. М. Каніс Проф. Магдалена Гетц Проф. Френк Штауб Дін: проф. Д-р мед. Лікар. hc.c. М. Рейзер, FACR, FRCR День усного іспиту: 09.06.2011
I Зміст Зміст Сторінка I. Вступ. 1 1. Важливість слуху. 1 2. Анатомія внутрішнього вуха. 2 3. Фізіологія вушної раковини. 5 3.1 Передача звуку та тонотопія. 5 3.2 Ендокохлеарний потенціал та механоелектрична трансдукція. 5 3.3 Посилення сигналу зовнішніми клітинами волосся. 7 3.4 Передача інформації через внутрішні клітини волосся. 11 4. Моторний білковий престин та тонка структура клітинної мембрани зовнішніх клітин волосся. 11 4.1 Ідентифікація Престина. 11 4.2 Тонка структура клітинної мембрани зовнішніх клітин волосся. 12 4.3 Структурна структура та локалізація престину. 13 4.4 Функція Престина. 15 5. Нелінійна ємність та електромобільність зовнішніх клітин волосся. 16 6. Холестерин та його вплив на процес слуху. 17 6.1 Хімічна структура та загальне значення. 17 6.2 Значення холестерину для плазматичної мембрани. 19 6.3 Вплив холестерину на внутрішнє вухо. 20 7. Питання та завдання. 24 II. Матеріал та методи. 26 1. Матеріал. 26 1.1 Пристрої. 26 1.2 Витратні матеріали. 27 1.3 Хімічні речовини та розчини. 27 1.3.1 Хімічні речовини. 27 1.3.2 Рішення. 28 1.4 Програмне забезпечення. 29
III Зміст 2. Рухомість зовнішніх клітин волосся у фізіологічних умовах. 53 3. Вплив холестерину на рухливість зовнішніх клітин волосся. 55 3.1 Загальні міркування. 55 3.2 Залежність моторики зовнішніх клітин волосся від концентрації холестерину. 56 3.2.1 Вплив холестерину на максимальне вкорочення та максимальне подовження. 56 3.2.2 Вплив холестерину на максимальний нахил, на середні зміни довжини та на напругу V pkc. 58 3.3 Вплив холестерину на моторний білок престин та клітинну мембрану зовнішніх клітин волосся. 60 3.3.1 Вплив хлориду на рухливість зовнішніх клітин волосся. 60 3.3.2 Вплив холестерину з функцією престину на половину максимуму. 62 V. Резюме та перспективи. 64 VI. Список скорочень. 68 VII. Список малюнків. 69 VIII. Список таблиць. 71 IX. Бібліографія. 72 X. Подяка. 78 XI. Публікації. 79 XII. Резюме. 81
I. Вступ 4 Рисунок 1: Анатомія внутрішнього вуха A: Огляд з розрізаною відкритою вушною раковиною B: Поперечний переріз через котушки вушної раковини C: Схематичне зображення органу Корті із зовнішніми та внутрішніми клітинами волосся (модифіковано з Hudspeth 2000 та Knirsch 2007) (Knirsch 2007 )
7 I. Вступ коливається між -60 і -80 мВ (Раджагопалан та ін., 2007) (рис. 3). Рушійною силою цих іонних струмів є різниця потенціалів між мембранним потенціалом волоскових клітин та ендокохлеарним потенціалом (Klinke et al. 2005; Schmidt 2007; Speckmann et al. 2008). Рисунок 3: Рецепторний потенціал як функція відхилення стереовілл (модифікований за Speckmann et al. 2008 та Rajagopalan et al. 2007) 3.3 Посилення сигналу зовнішніми волосяними клітинами Потік іонів у ETC та пов'язані з цим зміни потенціалу активують функцію посилення ÄHZ (Бренеман та ін., 2009). Ця підкріплююча функція базується на двох механізмах - соматичній та циліарній моториці. Обидва механізми збільшують вібрації біжучої хвилі до 1000 разів при активних рухах EHZ (Schmidt 2007; Dallos 2008). При циліарній моториці це відбувається за допомогою активних рухів стереовілл, тоді як соматична моторика заснована на подовженні та вкороченні клітинного тіла. Цей механізм, відомий як кохлеарний підсилювач, збільшує частотну вибірковість і чутливість слухового органу. Є ÄHZ за ототоксичними речовинами
I. Вступ 10 Рисунок 5: Циліарна рухливість (модифікована з Fettiplace 2006 та Breneman et al. 2009) Беручи разом поточні результати досліджень, Хадспет припустив, що циліарна рухливість являє собою свого роду попередній підсилювач та частотний модулятор, тоді як соматична рухливість діє як кінцевий підсилювач міг (Hudspeth 2008). Кохлеарний підсилювач працює динамічно. Він пропонує можливість посилення дуже низької інтенсивності звуку, тоді як велика інтенсивність звуку обробляється без посилення. Це запобігає пошкодженню внутрішнього вуха. Автоматичне регулювання коефіцієнта посилення у вигляді гальмівних ефектів забезпечує механічну рівновагу. Найкраще досліджений інгібуючий ефект опосередковується нейромедіатором ацетилхоліном. Ацетилхолін є головним передавачем еферентних волокон, що іннервують ГГЦ. Зв’язуючись із специфічними рецепторами, Ca 2+ надходить у клітину. Це призводить до уповільненого відтоку K + і, отже, до гіперполяризації клітини. Це призводить до зниження чутливості до напруги ВГЧ і гальмування електромобільності (Фроленков 2006; Ashmore 2008).
12 І. Вступ. Ліберман та ін. змогли підтвердити цю теорію в 2002 році. Вони показали, що при видаленні екзонів 3-7 кодуючого гена миші втрачали продукти спотворення отоакустичних випромінювань (DPOAE) та електромобільність EHZ, а також збільшували поріг слуху на 40-50 дБ (Liberman et al. 2002). 4.2 Тонка структура клітинної мембрани зовнішніх клітин волосся. Моторний білок престин знаходиться майже виключно в бічній клітинній мембрані ÄHZ (Ashmore 2008) (рис. 6). Малюнок 6: Структура бічної клітинної мембрани зовнішньої волосяної клітини (модифікована Oghalai et al. 1998) На верхівковому кінці ЕТС стереоворси прикріплені до кутикулярної пластинки. Ядро знаходиться в основі клітини. Клітинна мембрана бічної стінки має унікальну тришарову структуру. Зовнішній шар - це плазматична мембрана (ПМ), в яку закладено від 3000 до 6000 молекул престину на мкм². Щільність престину залежить від розташування ЕТС в равлику. Верхівкові ГГЦ, що
I. Вступ 14 Тривимірна реконструкція Престіна від Міо та співавт. в результаті утворився білок розміром 7,7 нм х 7,7 нм х 11,5 нм у формі кулеподібного пістолета з внутрішніми порожнинами (Mio et al. 2008) (рис. 8). Рисунок 7: Схематичне зображення структури та локалізації престину в плазматичній мембрані зовнішніх волоскових клітин (модифіковано від Ashmore 2008) Рисунок 8: Тривимірне зображення престину в плазматичній мембрані (змінено від Mio et al. 2008)
17 І. Вступ Порівняння з дослідженнями змін довжини ÄHZ з іншими методами, наприклад відеомікроскопія, використана в цій роботі (Ashmore 2008). Рисунок 10: Графічне зображення НЖК, руху заряду та зміни довжини як функція мембранного потенціалу (змінено з Ashmore 2008) Багато факторів, таких як напр. статус фосфорилювання внутрішньоклітинних білків або таких речовин, як хлороформ, гадоліній, саліцилати або холестерин, може впливати на ці процеси. Ви зміщуєте ці криві або в деполяризуючий, або в гіперполяризуючий напрямок, або змінюєте величину найбільшої зміни довжини або найбільшого руху заряду. У цій роботі було спеціально досліджено вплив холестерину на рухливість ЕГЗ (Ashmore 2008). 6. Холестерин та його вплив на процес слуху 6.1 Хімічна структура та загальне значення Нобелівський лауреат Майкл Браун описав холестерин як молекулу Януса (Berg et al. 2007). З одного боку, це незамінна частина наших клітин, з іншого боку, завдає шкоди людському організму, напр. внаслідок атеросклерозу (Yeagle 1985). Холестерин представляє важливу частину плазматичної мембрани більшості
25 I. Вступ Для того, щоб мати можливість диференціювати холестерин на клітинній мембрані та на моторному білковому престині, престинову функцію ЕТС слід зменшити, зменшивши концентрацію внутрішньоклітинного хлориду приблизно до 50% (Oliver et al. 2001). Потім ETC з половиною функції престину поділяють на дві тестові групи. Перша група досліджується з позаклітинною концентрацією холестерину 1,0 ммоль/л, друга група без доданого холестерину. Потім оцінка цих експериментів повинна дати відповідь на питання, чи більший вплив холестерину є наслідком впливу на пасивні властивості клітинної мембрани чи більше заснований на впливі на функцію моторного білка престину.
II. Матеріал і методи 26 II. Матеріал і методи 1. Матеріал 1.1 Підготовка обладнання Стереомікроскоп джерело холодного світла Приготування розчинів Wild M3C KL 1500 електронний осмометр з температурою замерзання Osmomat 030 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Німеччина Schott AG, Mainz, Німеччина Gonotec GmbH, Берлін, Німеччина Піпетки Довідковий Гамбург, Eppendorf AG, Стимуляція патч-скляного скляного електрода Знімач патча Настільний затискач Стіл/Клітка Фарадея Патч-затискач Підсилювач Патч-піпетка Тримач/підсилювач DMZ Універсальний знімач Micro-g Axopatch 200A CV-201A headstage Німеччина Zeitz Instruments GmbH, Martinsried, Німеччина TMC, Пібоді, Массачусетс, США Axon Instruments Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США Axon Instruments Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США
27 Аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200 Мікроманіпулятор Модель XR-6 Відеозаписи Мікроскоп Axiovert 135 Відеокамера Moticam 2000 II. Матеріал та методи Axon Instruments Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США Narishige Scientific Instrument Lab., Токіо, Японія Carl Zeiss AG, Göttingen, Німеччина Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Німеччина 1.2 Витратні матеріали для наконечників піпеток 10 мкл, 100 мкл, 1000 мкл боросиликатного скляного капіляра GC150TF-10 Покриття Петрі з полі-L-лізином (Ø 35 мм) Eppendorf AG, Гамбург, Німеччина Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, Редінг, Великобританія Greiner Bio-One GmbH, Фрікенхаузен, Німеччина 1.3 Хімічні речовини та розчини 1.3.1 Хімічні речовини Пентансульфонат натрію Розчинний у воді холестерин HBSS (збалансований сольовий розчин Хенкса) Sigma-Aldrich Co., Сент-Луїс, Міссурі, США Sigma-Aldrich Co., St Луї, Міссурі, США Biochrom AG, Берлін, Німеччина
II. Матеріал та методи 28 1.3.2 Розчини Розчини для піпеток (внутрішньоклітинні розчини) (у ммоль/л) Речовина Стандартний розчин Розчин з 6 ммоль/л хлориду KCl 140 6 Пентансульфонат натрію 0 134 MgCl 2 6H 2 0 2 2 EGTA 11 11 CaCl 2 0, 1 0,1 Гепес 10 10 КОН для встановлення значення pH 7,2 глюкози для встановлення осмолярності 315-320 мосмоль/л розчинів для ванн (позаклітинні розчини) (у ммоль/л) речовини стандартних розчинів розчину з (розчин HBSS) 0,1 ммоль/л, 0,5 ммоль/л, 1,0 ммоль/л, 1,5 ммоль/л холестерин 0 холестерин CaCl 2 1,25 1,25 глюкоза 5,55 5,55 KCl 5,4 5, 4 KH 2 PO 4 0,35 0,35 MgSO 4 7H 2 O 0,81 0,81 NaCl 137 137 Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,34 0,34 Hepes 5 5 NaOH для встановлення значення рН 7,2-7,4 глюкози для регулювання осмолярності 300-310 мосмоль/л
II. Матеріал та методи 32 Рисунок 13: Конфігурації вимірювання техніки затискачів та їх виготовлення (змінено з Numberger 1996) 1. Конфігурація, прикріплена до комірки: Конфігурація, прикріплена до комірки, відповідає вихідному положенню для всіх інших конфігурацій. У цій конфігурації неможливо втручатися у внутрішньоклітинне середовище клітини. Клітина вимірюється в стані, в якому всі білки, включаючи іонні канали, знаходяться в природному середовищі на внутрішньоклітинній стороні мембрани. Позаклітинний потенціал підсилювача контролюється лише ділянкою під піпеткою, пластиром.
II. Матеріал та методи Оснащений 34 рухомий мікроскопний стіл. Збільшене зображення було записано цифровою відеокамерою (Moticam 2000, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Німеччина) та збережено в цифровому вигляді на комп’ютері. Для розміщення патч-піпетки використовували гідравлічний мікроманіпулятор (модель XR-6, Narishige Scientific Instrument Lab., Токіо, Японія). Електрод для ванни всередині патч-піпетки був з'єднаний з попереднім підсилювачем (стійка CV-201A, Axon Instruments Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Малюнок 14: A: Структура вимірювальної станції затискача B: Збільшення мікроскопічного столу чашкою Петрі та пластирчатою піпеткою (модифіковано з Scheel 2002) (Scheel 2002) Негативний тиск, необхідний для аспірації клітин, створювався шприцом-перфузором, підключеним до тримача піпетки. Попередній підсилювач був підключений до підсилювача (Axopatch 200A, Axon Instruments Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США),
37 II. Матеріал та методи 2.2.6 Вимірювання опору електрода та корекція зміщення Піпетку заповнювали та затискали у тримачі піпетки так, щоб кінчик піпетки був занурений у розчин ванни. Невеликий надлишковий тиск запобігав засміченню піпетки всмоктаними частинками. За допомогою програми pclamp 8 протягом періоду 5 мс генерувався негативний тестовий імпульс напругою 5 мВ. За отриманою струмовою реакцією програма розрахувала струм опору електрода на основі закону Ома. Цей опір становив від 3 МОм до 6 МОм в тестах (Рисунок 15 А). Рисунок 15: Зміна опору та струмової реакції на тестовий імпульс, індукований патч-піпеткою, як функція конфігурації апарату затискного патча (змінено з Numberger 1996)
II. Матеріал і методи 38 Напруги, які не надходять від комірки або від тестового імпульсу, називаються потенціалами зсуву (Numberger 1996). Ці потенціали, спричинені поляризацією срібних/хлоридно-срібних електродів та потенціалами переходу між різними концентраціями електролітів у ванні та піпетці, можуть фальсифікувати результати вимірювань. Ці потенціали повинні бути компенсовані за допомогою підсилювача патч-фіксатора перед кожним вимірюванням і не повинні перевищувати 10 мВ (Numberger 1996). 2.2.7 Затискач цільної клітини та стимуляція Відповідні життєво важливі клітини відбирали під мікроскопом при малому збільшенні. Для оцінки клітин використовували критерії життєвості Заїча та Шахта (Zajic et al. 1987). Клітини демонстрували жорсткі на вигляд стереовіллі, клітинне ядро, розташоване біля базального полюса, невеликі випадкові рухи цитоплазматичних частинок і незмінну цілісну клітинну мембрану (рис. 16). Малюнок 16: Ізольована зовнішня клітина волосся з залишками опорної тканини та пластирчастої піпетки