Вплив метотрексату на метаболізм гомоцистеїну Дослідження лейкемії та
1 Вплив метотрексату на метаболізм гомоцистеїну: дослідження хворих на лейкемію та лімфому Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора наук (доктор технічних наук) математичного та природничо-наукового факультету Рейнського університету ім.
2 Підготовлено з дозволу факультету математики та природничих наук Рейнського університету ім. Фрідріха-Вільгельма-Бонна. Ця дисертація опублікована в електронному вигляді на університетському сервері публікацій ULB Bonn. 1. Доповідач: проф. Д-р У. Джехде 2-й доповідач: проф. Д-р День випуску Г. Бенди:
4 Я особливо хотів би подякувати своїй подрузі Джутті Шнайдер за її терпіння та готовність допомогти, особливо на завершальній фазі роботи. Нарешті, я хотів би подякувати моїй матері та моїм братам та сестрам, які завжди підтримували мене і завжди надавали надійну підтримку навіть у важкі часи.
5 Мій сімейний сумнів не є комфортним, але впевненість - абсурдним. Вольтер
6 Зміст 1 Вступ Гомоцистеїн Метаболізм гомоцистеїну Причини гіпергомоцистеїнемії Клінічні симптоми гіпергомоцистеїнемії та терапевтичні рекомендації Патомеханізми Метотрексат Хімічна структура Фармакокінетика Механізм дії Клінічне застосування Нейротоксичність МТХ Проблема та ціль Матеріал та методи Матеріали Хімікати та реагенти Аналізи, що застосовуються Розчини та речовини 35
7 Зміст Основи капілярного електрофорезу Розробка розділової системи для визначення збудливих амінокислот, що містять сірку (SEAA) Розробка методу Оптимізація методу для визначення SEAA в розчині Валідація методу СЕ Вимірювання зразків лікерів ВЕРХ аналіз Система ВЕРХ та хроматографічні умови Редукція та дериватизація попередньої колонки амінотіолів -оптимізаційний метод валідації вимірювання зразків флюоресценції поляризаційного імунологічного аналізу принцип вимірювання флюоресценції поляризаційного імунологічного аналізу виконання вимірювальних специфікацій системи IMx валідація методу FPIA шляхом часткової валідації методу FPIA для визначення гомоцистеїну при плазмових клінічних обстеженнях педіатричних хворих на гострий лімфоцитоз. 68
8 Зміст Дорослі пацієнти з первинною лімфомою центральної нервової системи Здорові дорослі (контрольна група) Повідомлення про пацієнта з передозуванням МТХ Фармакокінетичні розрахунки Кліренс AUC Статистичний аналіз даних Описова статистика Статистичні тести для перевірки диференціальних гіпотез Кореляційний аналіз Регресійний аналіз Результати Метод СЕ для визначення збудливих амінокислот, що містять сірку в Поділ ліквору в збудливих амінокислотах, що містять сірку Оптимізація дериватизації Порівняння чутливості детектування УФ та LIF Метод оптимізації для аналізу КЖС Валідація Метод ВЕРХ для визначення цистеїну, гомоцистеїну та глутатіону в СМЖ. 111
9 Зміст Розробка методу/оптимізація Валідація методу ВЕРХ Результати часткової валідації FPIA Вплив високих доз МТХ на метаболізм гомоцистеїну Дослідження у педіатричних хворих на гострий лімфобластний лейкоз (Дослідження Total XV) Дослідження у пацієнтів з PZNSL Передача випадку пацієнта з передозуванням МТХ Обговорення Метод СЕ для визначення сірчистих, збудливих амінокислот у методі ВРХ ВЖС для визначення гомоцистеїну, цистеїну та глутатіону в СМЖ Вплив хіміотерапії високими дозами МТХ на метаболізм гомоцистеїну Дослідження у педіатричних пацієнтів з ВСІ дослідженнями у пацієнтів з ПЗНСЛ Пацієнт із передозуванням МТХ Гомоцистеїн біомаркер МТХ-індукованої нейротоксичності? Підсумок літератури Додаток. 222
10 Список скорочень ABDF AG AICAR AICAR-TF AK AL ALL ASP ATP BHMT C1 (8), (15) C1h23 (42) C15h23 (42) CA CBQCA CBS CGL CFSE cp ss CNS CSA CV CYS DAMPA DHB DHF DHFR DHP DHPR 4- ( Аміносульфоніл) -7-фтор-бензофуразан антиген аміноімідазол-карбоксамід-рибонуклеотид аміноімідазол-карбоксамід-рибонуклеотид трансформілаза антитіло робочий розчин Гострий лімфатичний лейкоз L-аспарагінова кислота (аспартат) аденозин трифосфат бензоїн або гомоцитрат або бензофуразан Аміноімідазол трифторметанола консолідації 1-й день консолідації, 23 (42) години після початку інфузії високих доз МТХ 15-й день консолідації, 23 (42) години після початку інфузії високих доз МТХ Цистеїн сульфонова кислота 4- (2-формил-3-хінолін карбоніл) -бензойна кислота цистатіонін-β-синтаза цистатіонін-γ-ліаза 5-карбоксифлуоресцеїнсукцинімідиловий ефір рівноважна концентрація в центральній нервовій системі плазми (центральна нервова система) цистеїн сульфінова кислота коефіцієнт варіації (коефіцієнт варіації) цистеїн 2,4-діаміно-N 10-метил-п тероєва кислота дигідробіоптерин дигідрофолієва кислота (дигідрофолат) дигідрофолат-редуктаза
11 DMF DTT E ECD EDTA EOF FD FDA FGAR FICAR FITC FPGS FPGH FPIA FQCA FR GAR GAR-TF GLU GSH GTP HCY HCSA HCA HDMTX HR ICV ICVMTX IMP IT ITMTX IV N, N-диметилформамід детермінація електрохімічної електрохімічної електрохімічної електрохімічної електрохімічної електрохімічної електрохімічної електрохімічної детермінованої електрохімічної електрохімічної детекції продукти харчування та ліками Formylglycinamidribonukleotid 5-формамід-імідазол-4-carboxamidribonukleotid флуоресцеїну фолієвої кислоти фолієвої кислоти Polyglutamatsynthetase Polyglutamathydrolase поляризації флуоресценції імуноаналізу 3- (2-фуро) хінолін-2-карбальдегід фолату рецептора Glycinamidribonukleotid Glycinamidribonukleotid трансферази глутамінової кислоти (глутамату) глутатіон гуанозинтрифосфат гомоцистеїн Homocysteinsulfinsäure Гомоцистеїн сульфонова кислота Високодозова терапія метотрексатом (вводиться внутрішньовенно) Високий ризик Внутрішньомозково-шлуночковий Внутрішньомозково-шлуночковий введення Метотрексат Внутрішньом’язово Інозин монофосфат Внутрішньовенно Внутрішньовенно вводять метотрексат Внутрішньовенно
12 K KPF LDL LIF (D) LLOQ LOD LR MAT ME MP MEKC MeOH mfbp MS MTHFR MTX MTX Контрольна група Виправлена площа піку Ліпопротеїди низької щільності Лазерно-індукована флуоресценція (виявлення) Нижня межа кількісного визначення (нижня межа квантування) Межа виявлення (межа виявлення) Низька метіонін аденозил? ризик трансфераза меркаптоетанол mercaptopropanol міцелярного електрокінетіческой хроматографія метанол мембранно-пов'язаний фолат-зв'язуючий білок метіонінсінтетаз N 5, N 10 -метілен тетрагідрофолат редуктаза метотрексат метотрексат поліглютамату (е) μ е електрофоретичної рухливість μOForetic рухливість Х μOF ефективної електрофоретичної рухливість electrohor N 5 -FTHF N 10 -FTHF NHL N 5, N 10 -MTHF N 5 -MTHF NMDA PRPP PO PZNSL QC-Зонд r N-ацетилцистеїн N 5-формил тетрагідрофолат N 10-формил тетрагідрофолат Неходжкінська лімфома N 5, N 10 - Метилентетрагідрофолат N 5-метилтетрагідрофолат N-метил-D-аспартат α-5-фосфорибозил-1-пірофосфат per os (перорально) Первинна лімфома центральної Ne коефіцієнт кореляції вибірки контролю якості зразків rvensystems
13 RE RFC RI ROS RSD S SD SAH SAHH SAM SBDF SDS SEAA SHR SL SR ss t ½ TBP THB THF TIT ULOQ v VK Відносна похибка (відносна похибка) Знижена ремісія/індукція фолієвого носія Відносні стандартні відхилення (коефіцієнт варіації) Стандартне стандартне відхилення (Стандартне відхилення) S-аденозилгомоцистеїн S-аденозилгомоцистеїн гідролаза S-аденозилметионін 4- (сульфо) -7-фтор-бензофуразан натрію додецилсульфат Сірковмісні збудливі амінокислоти (сірковмісні, збудливі стійкі амінокислоти) стандартний/підвищений ризик основний розчин стандартний/підвищений ризик Період напіввиведення Трибутилфосфін Тетрагідробіоптерин Тетрагідрофолієва кислота (тетрагідрофолат) Інтратекальна потрійна терапія Верхня межа кількісної оцінки (верхня межа кількісної оцінки) Швидкість міграції Коефіцієнт варіації x середнє значення x
Медіана Z Трансформований коефіцієнт кореляції ЦНС Центральна нервова система
19 Page 6 Вступ Нестача свіжих фруктів та овочів, дефіцит фолієвої кислоти є найпоширенішим дефіцитом вітамінів у Європі. Середньодобове споживання фолієвої кислоти з їжею (
25 Page 12 Вступ Нейротоксичні реакції, опосередковані гомоцистеїном, можуть бути значно зменшені введенням антагоністів рецепторів NMDA 67,71,72. Cl - канал Ca 2+ канальний каїнат NMDA AMPA mglu Na + Na + Na + PLC Cl - Ca 2+ IP 3/DAG протеази (Кальпаїн I/II), фосфоліпази (PLA 2, PLC), ендонуклеази, протеїнкінази (CaMPK II, PKC), перекисне окислення ліпідів синтазою NO, пошкодження цитоскелету, ДНК та мітохондрій Осмотичний лізис, апоптоз Рис. 1-3: Механізм екситотоксичності. Абревіатури: Kainate: рецептор Kainate; NMDA: N-метил-D-аспартат (рецептор); AMPA: L-α-аміно-3-гідрокси-5-метилізоксазол-4-пропіонова кислота (рецептор); мглу: метаботропний рецептор глутамату; PLC: фосфоліпаза С; IP 3: інозитолтрифосфат; DAG: Діацилгліцерин Також обговорюється, що індуковані гомоцистеїном атеросклеротичні зміни в судинах головного мозку можуть призвести до ішемії та гіпоксії, а отже, нейрони можуть бути пошкоджені 77. Цистеїн також підозрюється в тому, що він викликає нейротоксичні ефекти у більш високих концентраціях. Ця адитивна токсичність може бути тоді особливо важливою виникають, коли гематоенцефалічний або геліколікворний бар’єр пошкоджений інфільтрацією пухлин або випромінюванням, і більша кількість цистеїну може потрапити з крові в ЦНС.
29 Page 16 Вступ мають подібні МТХ, а також здатні безпосередньо інгібувати ферменти біосинтезу пуринів, вони мають велике значення для цитотоксичності. HNN NH 2 NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O COOH MTX карбоксипептидаза альдегідоксидаза HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 фолієва кислота поліглутамат синтетаза HOOC HN HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 OO 2,4-діаміно-N 10-метилптерова кислота DAMPA) HNN COOH NH 2 7-гідроксиметотрексат (7-OH-MTX) NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O CO (GLU) n Поліглутамат метотрексату (MTX-PG) Рис. 1-5: Метаболізм MTX.
32 Вступна сторінка 19 Гліцинамід рибонуклеотид (GAR) або 5-аміноімідазол-4-карбоксамід рибонуклеотид стоять. 2- O3 PO CH 2 O PRPP OH OOOPOPO - OH O - O - OH 2 NH 2 NN AICAR N Рибоза P 2- O3 PO CH 2 OH O HN OH C CH 2 O GAR NH 2 AICAR-TF X MTX-PG ON 10 -FTHF THF GAR-TF MTX-PG XN 10 -FTHF THF OH 2 N CH HN N FICAR N Ribose PH 2 CCOHN CH O NH Ribose P FGAR OH 2 O HN NN IMP N Ribose P Рис. 1-7: Взаємодія MTX-PG із синтезом de novo пуринових основ (вибрані стадії). Абревіатури: PRPP: α-5-фосфорибозил-1-пірофосфат, GAR: гліцинамід рибонуклеотид, GAR-TF: GAR трансформанілаза, FGAR: формилгліцин амід рибонуклеотид, N 10 -FTHF: N 10-формул тетрагідрофолат, THF: тетрагідрофолат, THF: 4-карбоксамід рибонуклеотид, AICAR-TF: AICAR трансформанілаза, FICAR: 5-формамідо-імідазол-4-карбоксамід рибонуклеотид, IMP: інозин монофосфат.