Встановлення та аналіз моделей нокаутованих мишей субодиниць σ1 комплексу AP-1 - PDF

Встановлення та аналіз нокаутованих моделей мишей σ1-субодиниць комплексу AP-1 Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора математичних та природничих факультетів університету Георга Августа в Геттінгені, представлена Дженніфер Балтес із Саарбрюккен Геттінген 2008

D7 Доповідач: проф. Д-р Інститут біохімії ім. К. фон Фігури II, Центр біохімії та молекулярно-клітинної біології Геттінгенського університету імені Георга-Августа Співвикладач: проф. Інститут мікробіології та генетики ім. Р. Фікнера при Університеті Георга Августа в Геттінгені. День усного іспиту: 22 січня 2008 р.

Зміст I Зміст 1. Вступ. 1 1.1 Везикулярний транспорт. 1 1.1.1 Клатрин. 4 1.1.2.1 АР-1, опосередковане утворенням везикул. 11 1.1.2.2 Мотиви розпізнавання білкового адаптера. 13 1.1.2.3 Взаємодія AP-1 з допоміжними білками. 16 1.1.3 Адаптери GGA. 19 1.1.4 Транспорт, опосередкований AP-1. 22 1.2 Вибивні моделі миші AP-1 Adaptine. 25 1.2.1 Фенотип γ-нокаутованих мишей. 25 1.2.2 Фенотип нокаутованих мишей µ1. 26 1.2.3 Фенотип нокаутованих мишей σ1b. 26 2. Питання. 28 3. Матеріал і методи. 29 3.1 Часто використовувані рішення та пристрої. 29 3.1.1 Буфери. 29 3.1.2 Культурні середовища. 29 3.1.3 Пристрої. 30 3.1.4 Центрифуги та ротори. 30 3.2 Молекулярно-біологічні методи. 31 3.2.1 Виділення геномної ДНК з біопсій хвоста. 31 3.2.2 Осадження ДНК етанолом. 31 3.2.3 Фенол-хлороформова екстракція ДНК. 32 3.2.4 Виділення РНК з тканин. 32 3.2.5 Кількісне визначення нуклеїнових кислот. 33 3.2.6 ПЛР. 3.2.6.1 ПЛР-підхід для генотипування мишей σ1b -/- -. 35 3.2.6.2 ПЛР для генотипування мишей генної пастки σ1a. 36 3.2.7 Обмежувальне перетравлення ДНК. 38 3.2.8 Поділ ДНК за допомогою гель-електрофорезу на агарозних гелях. 38 3.2.9 Вилучення ДНК з агарозних гелів. 40 3.2.10 Лігування фрагментів ДНК. 41

Зміст III 3.5 Біохімічні методи білка. 58 3.5.1 Вилучення цілком клітинного білка з клітин. 58 3.5.2 Виробництво гомогенату тканини. 58 3.5.3 Визначення білка за Бредфордом. 59 3.5.4 Електрофорез у поліакриламідному гелі (SDS-Page) за Леммлі. 59 3.5.5 Перенесення білка в нітроцелюлозу (вестерн-блот). 62 3.5.5.1 Напівсуха пляма. 63 3.5.5.2 Вологий промок. 63 3.5.5.3 Імунозабарвлення на мембранах нітроцелюлози/PVDF. 64 3.6 інші методи. 66 3.6.1 ІФА для вимірювання концентрацій різних адипокінів у сироватці крові. 66 3.6.2 Аналіз FACS (сортування клітин, що активується флуоресценцією) ізольованих адипоцитів. 67 3.6.3 Забарвлення адипоцитів маслом червоним О. 67 4. Результати. 69 4.1 Фенотипування дефіцитного σ1b штаму миші. 69 4.1.1 Водний баланс мишей з дефіцитом σ1b. 69 4.1.2 Аналіз сироватки мишей з дефіцитом σ1b. 78 4.1.3 σ1b-залежна функція жирової тканини. 79 4.1.3.1 Характеристика жирової тканини. 80 4.1.3.2 Функціональне дослідження жирової тканини. 83 4.1.3.2.1 Толерантність до глюкози мишей з дефіцитом σ1b. 83 4.1.3.2.2 Концентрація адипоцитокінів у сироватці крові. 85 4.1.2.3.2 Вплив дієти з високим вмістом жиру на вагу мишей із дефіцитом σ1b. 87 4.1.3.3 Диференціація жирової тканини. 90 4.1.4 Поведінкові дослідження на мишах з дефіцитом σ1b. 100

Абревіатури V Скорочення Å Ångström Рис. Рисунок оголошення заповнюється до остаточного обсягу aqua destillata ADP аденозин дифосфат AP адаптер білковий комплекс APS амоній персульфат ARF ADP-фактор рибозилювання BFA Brefeldin A bp пара пар BSA бичача сироватка альбумін C градуси Цельсія CCV покритий клатрином cdna комплементарна ДНК Ci Curie (2,22x10 6 відліків в хвилину) COP Дезоксиаденозин трифосфат dctp дезоксицитидин трифосфат DEPC діетилпірокарбонат dgtp дезоксигуанозин трифосфат, тобто це означає, що DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium dntp дезоксирибонуклеотид ДМСО диметилсульфоксид ДНК дезоксирибонуклеїнова кислота ДНК дезоксикислота ДНК дезоксикислота ДНК дезоксикислота ДНК дезоксикислота ДНК дезоксикислота ДУА

Абревіатури VI EGF фактор росту епітелію ІФА Імуноферментний імуноферментний аналіз Вбудований ENTH епсин N-кінцева гомологія ER Ендоплазматичний ретикулум ERGIC ER-Гольджі проміжний відсік ES ембріональні стовбурові клітини та ін. et alii (лат.: та інші) EtBr етидіум бромід FACS активоване флуоресценцією сортування клітин FKS фетальна теляча сироватка, грами GAE γ-адаптант-вухо-гомологічний GAP GTPase-активуючі білки GAPDH гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа GGA та TOM1 ВВП гуанон ВВП-нуклеотидний обмінний фактор GGA Локалізований за Гольджі, γ-вухосодержащий, ARF-зв’язуючий білок GLUT4 транспортер глюкози 4 GTP гуанозинтрифосфат h година H 2 O вода, тобто 2 O дистильована вода HRP пероксидаза хрону IgG імуноглобулінG ip внутрішньочеревно k кіло kb кілобази ko вибити L літр LB лізогенний відвар M моляр

Абревіатури VII mа міліампер MEF мишачі ембріональні фібробласти мг міліграми хв хвилина мл мілілітри мм міліметри мм мілімолі мм рт.ст. міліметри ртуті MOPS 3- (N-морфоліно) -пропансульфонова кислота MPR манноза-6-фосфатний рецептор mrna messenger nm рибонуклеїнова кислота мкг нм нм нм n-кінцевий амінотермінал OD оптична щільність PAA поліакриламід PBS фосфатно-сольовий сольовий розчин ПЛР полімеразна ланцюгова реакція ph негативний декадичний логарифм концентрації протонів PI-3-P фосфатидилінозітол-3-фосфат PI-4-P фосфатидилінозитол-4-фосфат PI-4,5P 2-фосфат PI-4,5P 2-фосфат, 5-бісфосфатна РМ плазматична мембрана пікомолярний PP2A білок фосфатаза 2A PVDF полівінілідендифторид РНК рибонуклеїнова кислота РНКаза рибонуклеаза RT кімнатна температура об/хв об/хв див. SDS додецилсульфат натрію

Абревіатури VIII SNARE SSC сек Tab. Taq TE TEMED TGN Tris U ü.n. UV V див. VHS WT w/v v/v xg напр. "Рецептори приєднання SNAP і NSF" стандартний сольовий цитрат друга таблиця Thermophillus aquaticus Tris/HCl EDTA N, N, N, N тетраметилдіамін транс-мережа Гольджі одиниця ферменту (одиниця) за ніч ультрафіолетове світло вольт порівнює Vps27p, Hrs та STAM дикого типу Наприклад, відношення обсягу до об'єму в х разів прискорення внаслідок сили тяжіння

Вступ 7 колокалізований (Simpson et al., 1997; Peden et al., 2004). Наразі в очищених CCV з тканини мозку не виявлено АР-3 (Simpson et al., 1996; Dell'Angelica et al., 1997b; Blondeau et al., 2004). Функціональні дослідження з мутованим мотивом зв'язування клатрину AP-3 також не показали взаємодії. Однак, як виявляється, у клітині існують як клатринові, так і вільні від клатрину популяції (Peden et al., 2004). Зв’язані з AP-3 CCV можуть бути виділені з людської епітеліальної клітинної лінії пухлини HeLa (Borner et al., 2007). Отже, може бути, що зв'язування клатрин-AP-3 є дуже крихким, або що кількість AP-3-зв'язуючих, покритих клатрином пухирців змінюється в різних типах клітин (Newell-Litwa et al., 2007). Комплекс AP-4 не має класичної клатринової коробки, і специфічної взаємодії не виявлено. Однак AP-4 було виявлено поблизу клатрину на знімках з електронним мікроскопом (Barois and Bakke, 2005). Малюнок 3: Конкретні транспортні шляхи, опосередковані адаптерними білками TGN: мережа Транс-Гольджі; b ee: базолатеральна рання ендосома; aee: верхівкова рання ендосома; Lys: Lysosom, re: recycling Endosom для подальших пояснень див. Текст (за Schu, 2005).

Вступ 9 має сайт зв'язування, але субодиниця µ1, на відміну від µ2, не має фосфатидилінозитолфосфатного мотиву. Малюнок 4: Структура та склад (a) AP-1 та (b) AP-2 Окремі субодиниці ідентифікуються відповідними кольорами, як показано на схемах (b) та (d). Відповідний сайт зв'язування YxxΘ виділений овалом і сайт зв'язування PI-4-P в AP-1 та сайт зв'язування PI-4,5-P 2, зайнятий D-міо-інозитол-гексакісфосфатом (IP6) в AP2 колом. Порівняно з субодиницею µ2, у субодиниці µ1 АР-1 відсутній сайт зв’язування фосфатидилінозитолу. (Collins et al., 2002; Heldwein et al., 2004) Ядро адаптерних комплексів вимірює приблизно 100 Å x 80 Å, при цьому шарнірний домен двох великих субодиниць, ймовірно, розширюється до 200-300 Å, оскільки він не має стабільної вторинної структури. Отже, вушні домени можуть розташовуватися далеко від мембранозв’язаного ядра комплексу та взаємодіяти з іншими білками цитоплазми.

Вступ 10 Рисунок 5: Схематичне зображення різних ізоформ субодиниць AP-1. Дві ізоформи відомі як для γ, так і для μ1. Існують навіть три ізоформи, описані для σ. σ1b було виявлено у трьох варіантах сплайсингу. Для багатьох адаптинів у ссавців описані ізоформи, кодовані кількома генами. Додаткові варіанти сплайсингу були знайдені лише для α-адаптину. У випадку AP-1 експресується принаймні одна альтернативна ізоформа для всіх задіяних білків, за винятком субодиниці β1. Схематична компіляція цих білків показана на малюнку 5. Ізоформа γ2 на 60% гомологічна γ1 адаптину. Він укорочений у змінній шарнірній області. На відміну від субодиниці γ1, в гібридній системі дріжджів не може бути виявлено взаємодії між γ2 та субодиницею β. Це говорить про те, що не існує комплексу in vivo з γ2. Відомі три гени σ1-адаптин, σ1a, -B та -C. Вони виявляють 70-80% ідентичності на рівні білка (Riel, 2004). In vitro σ1a та σ1b зв'язуються з обома γ-ізоформами (Takatsu et al., 1998; Takatsu et al., 2001). Крім того, у нашій лабораторії було виготовлено три різні варіанти сплайсингу

Вступ 15 Як правило, перед ними перебувають кілька кислих амінокислотних залишків, які також називаються кислими кластерними мотивами ділейцину. У цьому випадку аспартат (D) не можна замінити. На відміну від сигналів (D, E) xxxL (L, I), DxxLL не зв'язується з комплексами AP in vitro, а з мономерними адаптерами сімейства GGA (Puertollano et al., 2001; Zhu et al., 2001 ) (див. 1.1.3). Інше сімейство сортувальних мотивів складається з послідовності амінокислот, які містять від одного до трьох місць фосфорилювання казеїнкінази II (CKII). Цей мотив міститься у багатьох трансмембранних білках, які циркулюють між TGN та ендосомами. Фосфорилювання CK-II головним чином необхідне для зворотного транспорту з ендосом до TGN. Для білка PACS1 (фосфофуриновий кластерний сортуючий білок 1) можна було б показати, що він пов'язує фосфорильовані кислотні групи, а також AP-1 і AP-3. Поверхня зв'язування на AP-1 була ідентифікована на µ і σ (Wan et al., 1998; Crump et al., 2001).

Вступ 16 1.1.2.3 Взаємодія AP-1 з допоміжними білками Рисунок 6: Мережа AP-1 та його партнери по взаємодії З'єднувальні лінії між окремими білками символізують взаємодію. Описано додаткових партнерів по взаємодії, які, як вважають, створюють середовище, специфічне для CCV AP-1. Більшість з цих допоміжних білків зв’язуються з вушними доменами великих субодиниць AP-1, причому взаємодія γ1 має найвищу спорідненість. Оскільки ці домени виявляють найменшу схожість серед адаптинів, встановлюються дуже специфічні зв’язки. На фіг.6 показано білки, що зв'язують AP-1, і взаємодії між компонентами символізовані лініями. Не всі з цих білків можна детально обговорити нижче, тому я обмежусь лише тими, щодо яких доступна більшість інформації. Функції більшості цих білків невідомі, і важливість зв'язування з AP-1 досліджували лише декілька. Остання група включає ARF1GAP, який необхідний для розчинення білкової оболонки. Ви також можете використовувати Rabaptin5

Введення 19 викликають залишки цих асоційованих білків за ідентифікованими мотивами, WVQF та WGDF (Mattera et al., 2004). 1.1.3 Адаптери GGA Мономерні білки GGA (локалізовані за Гольджі, містять γ-вухо, ARF-зв’язуючі білки) сприяють утворенню білків, покритих клатрином, на TGN. Білки GGA були ідентифіковані в базах даних на основі гомології одного з їх доменів до γ-адаптаційного вушного домену та вивчені щодо їх ролі в процесах сортування в TGN (Bonifacino, 2004). Вони також є на ендосомах. Три гени були описані у ссавців, коди яких є GGA1, GGA2 та GGA3. Сім'я зберігається у еукаріотів, а дріжджі також мають два білки GGA. Білки GGA мають модульну структуру (див. Малюнок 7). Три складені домени пов'язані між собою неструктурованими послідовностями. Рисунок 7: Модель структури GGA1 Структури окремих доменів були об'єднані тут, щоб сформувати модель, і їх партнери по зв'язуванню були призначені для окремих доменів. Змінено з (Ghosh and Kornfeld, 2004)