Захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae а
1 Захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae багатошаровою біополімерною системою: вплив на її метаболічну активність у відповідь на умови навколишнього середовища Thanh Dat Nguyen Навести цю версію: Thanh Dat Nguyen. Захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae багатошаровою біополімерною системою: вплив на її метаболічну активність у відповідь на умови навколишнього середовища. Мікробіологія та паразитологія. Université de Bourgogne, Français . HAL Id: tel Надіслано 19 квітня 2017 р. HAL - це міждисциплінарний архів відкритого доступу для зберігання та розповсюдження науково-дослідних документів, незалежно від того, публікуються вони чи ні. Документи можуть надходити від навчальних та дослідницьких установ у Франції чи за кордоном, або від державних або приватних дослідницьких центрів. Мультидисциплінарний відкритий архів HAL призначений для зберігання та розповсюдження наукових документів наукового рівня, опублікованих чи ні, від французьких або зарубіжних навчальних та дослідницьких установ, державних чи приватних лабораторій.
2 UNIVERSITÉ DE BOURGOGNE AGROSUP DIJON НАЦІОНАЛЬНИЙ СУПЕРІОРНИЙ ІНСТИТУТ АГРОНОМІЧНИХ, ПРОДОВОЛЬСЬКИХ І НАВКОЛОГИЧНИХ НАУК UMR PAM (Харчові та мікробіологічні процеси) ДЕЗ представлено AgroSup Dijon з метою отримання ступеня доктора Бургундського університету з біологічних технологій. Мікробна біохімія, мікробіологія, фізико-хімія NGUYEN Thanh Dat Захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae багатошаровою біополімерною системою: вплив на її метаболічну активність у відповідь на умови навколишнього середовища Захист 17/10/2016 перед екзаменаційною комісією: пр. Монік АЛРІК Доповідач, ун-т. d Овернь Доктор Надія ОУЛАХАЛ Доповідач, ун-т. Ліон 1 Доктор Фернанда ФОНСЕКА Доктор Стефан ГЮЙО Доктор Флоренс ХАССОН Прем'єр-міністр Ремі САУРЕЛ, експерт INRA, експерт AgroSup Dijon, директор дисертації AgroSup Dijon, AgroSup Dijon NGUYEN THANH DAT, 2016
4 Сільві, Карін, Себастьян, Паскаль, Олександр, Кіріл, Бернадетта, Олександра, Жером, Жан-Крістоф, Антонін і ще раз Дякую моїм колегам-докторам та докторантам Антоніо КАМАРІ, Софал ТРІ, НГУЄН ТІ Кім Чі, НГУЙЕН Тхі ЧТ та Manhal YOUSSEEF за обмін знаннями, досвідом та приємними моментами докторського життя в лабораторії. Я хотів би подякувати Жану-Люку МЕССІОНУ та Елен СКОРНЕК, двом колегам, які допомогли мені, коли мені це було потрібно під час дипломної роботи. Їх дослідницький дух підняв мою мотивацію у важкі часи. Я закінчую тим, що дуже дякую своїм батькам та дружині Бао Нгок за їхню невпинну підтримку. Без них без мене. Нарешті, я хотів би присвятити цю тезу своєму синові Даніелю Ану Дую. ii
11 Рисунок 24. Виживання трьох штамів BY4742, ΔGSH1 і ΔGSH2 після дегідратації (0,23 aw при 25 C, швидка регідратація) представлено log 10 (N/N 0), де N 0 і N - кількість колоній. дріжджі, отримані до та після дегідратації Рисунок 25. Концентрація загального глутатіону (тверді бруски) та рівень відновленого/загального глутатіону (порожнисті бруски) дріжджів, культивованих у двох середовищах G- (зелені бруски) та G + (червоні смужки). G- та G + означають дріжджі перед зневодненням. G-25 і G + 25 вказують на дріжджі, зневоднені при 25 C. G-45 і G + 45 вказують на дріжджі, дегідратовані при 45 C. Відносна вологість повітря підтримувалася на рівні 23% під час зневоднення Рисунок 26. Ферментна активність глутатіонредуктази з дріжджів, культивованих Saccharomyces cerevisiae у двох середовищах G- і G + в умовах дегідратації при двох температурах 25 С і 45 С Малюнок 27. Концентрація глутатіону дріжджів Saccharomyces cerevisiae, культивованих у середовищі G- (A) та G + (B). G + і G + 45 відповідають неінкапсульованим клітинам. G + EN та G + EN45 відповідають інкапсульованим клітинам. Абревіатури подібні для середовища G ix
13 Абревіатури Символи aw: активність води T: температура ζ: дзета-потенціал Акроніми ДНК: дезоксирибонуклеїнова кислота Alg: альгінат асим: асиметричний Blg: β-лактоглобулін CFU: Колонія Формуючий блок CTA: каталаза DO: оптична щільність DRO: реакційноздатні похідні l кисню DTNB: 5,5'-дитиобіс- (2-нітробензойна кислота) EtOH: етанол FTIR: Трансформація Фур'є Інфрачервоний G-: стан не збагачений глутатіоном G +: стан збагачений глутатіоном G + 2325: дріжджі із середовища G + зневоднені при 23 % відносної вологості та при 25 CG + EN: дріжджі, культивовані в середовищі, інкапсульованому G + GPX: глутатіонпероксидаза GR: глутатіонредуктаза GSH: відновлений глутатіон GSSG: окислений глутатіон IFTR: перетворення Фур'є інфрачервоне IFTR-S: перетворення інфрачервоного Фур'є з джерелом синхротрону LbL: пошаровий SEM: скануюча електронна мікроскопія TEM: просвічувальна електронна мікроскопія NADPH: нікотинамід аденин динуклеотид фосфат PAA: полі (акрилова кислота) PAH: полі ( аліламінгідрохлорид) xi
14 PAM: харчові та мікробіологічні процеси PAPC: харчові та фізико-хімічні процеси PCA: аналіз основних компонентів PDDA: полі (діаллдиметиламмоній хлорид) PE: поліелектроліт PGA: полі (глутамінова кислота) PLL: полі (лізин) PMAA-co-NH 2: Полі (метакрилова кислота), що містить аміно PMB: мікробіологічні та біотехнологічні процеси PSS: полі (стиренсульфонат натрію) PVPON: полі (n-вінілпіролідон) RH: відносна вологість SOD: супероксиддимутаза sym: симетричний TNB: 2-нітро-5-тіобензоат TRX: УФ-тіоредоксин: ультрафіолет xii
15 Зміст ПЕРЕДМОВА. 1 РОЗДІЛ 1. БІБЛІОГРАФІЧНИЙ РЕЗЮМЕ Saccharomyces cerevisiae Основні характеристики дріжджів Saccharomyces cerevisiae Морфологія та метаболізм дріжджів Розмноження дріжджів Фази росту клітин Життєвий цикл Походження різних видів штамів Дріжджі Умови культури Роль дріжджів Saccharomyces cerevisiae Виробництво заквасок хліб Виробництво алкогольних напоїв Виробництво пробіотиків Виробництво пального етанол Вплив різних стресів промислових процесів на дріжджі Saccharomyces cerevisiae Окислення Етанол Осмотичний стрес Температура Захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae проти процесу зневоднення Глутатіон Роль глутатіону Озбавлення гліотіонід глютатіонід глютоніонід гліцериди ферменти Трегалоза Інкапсуляція (оглядова стаття) Контекст, цілі та стратегії РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ Штам дріжджів та умови культури xiii
17 3. Вибір тендітного штаму та умови зневоднення Вибір тендітного штаму Умови дегідратації/регідратації Вплив збагачення глутатіону на стійкість дріжджів за вибраних умов дегідратації (стаття 2) Вплив капсуляції на стійкість дріжджів до зневоднення (стаття 3) Додаткові результати ГЛАВА 4. ЗАГАЛЬНИЙ ВИСНОВОК І ПЕРСПЕКТИВИ Загальний висновок Перспективи ПОВНИЙ СПИСОК БІБЛІОГРАФІЧНИХ ЛІТЕРАТУР xv
20 ПЕРЕДМОВА Біохімічні зміни в клітинах під час зневоднення. Крім того, інфрачервона спектроскопія перетворення Фур'є із синхротронним джерелом була використана для вивчення біохімічних змін дріжджів на одноклітинній шкалі під час дегідратації. У першій главі цієї дипломної роботи, що відповідає огляду літератури, представлені дріжджі Saccharomyces cerevisiae та їх реакція на порушення навколишнього середовища, а також шлях, що веде до захисту клітин. У другому розділі цього документа зібрано матеріали та методи, використані під час цієї дослідницької роботи. У третьому розділі представлені та обговорені отримані результати (у формі наукових статей, опублікованих або в процесі подання, та додаткових результатів). Нарешті, загальний висновок містить основні розроблені моменти та пропонує перспективи. 3
42 ГЛАВА 1. БІБЛІОГРАФІЧНИЙ РЕЗЮМЕ повідомляє, що захисний ефект трегалози проявляється, коли її внутрішньоклітинна концентрація досягає 20 мкг/мг біомаси (Eleutherio et al., 1993; Benaroudj et al., 2001; Richards et al., 2002; Pereira de Юсус та ін., 2003). Трегалоза може захистити дріжджі від осмотичного та окисного стресу через зневоднення клітинної мембрани. Під час осмотичного стресу трегалозу можна вводити для заміщення молекул води в клітинній мембрані та зменшення порушення мембрани (Crowe et al., 1984). З іншого боку, накопичення трегалози дозволяє зменшити перекисне окислення ліпідів у дріжджах (Herdeiro et al., 2006). Крім того, трегалоза має здатність кріозахищати в процесах зневоднення при низькій температурі. Додавання 10% трегалози в середовище збільшує виживання клітин в умовах заморожування (Coutinho et al., 1988). 25
59 ГЛАВА 1. БІБЛІОГРАФІЧНИЙ РЕЗЮМЕ Тедескі К., Х. Мевальд та ін. (2001). "Полярність пошарових осаджених плівок поліелектролітів, що визначається флуоресценцією пірену". Журнал Американського хімічного товариства 123 (5): Thomas, M. B., M. Vaidyanathan, et al. (2014). "Підвищена життєздатність пробіотичних Saccharomyces boulardii, інкапсульованих пошаровим підходом, у поліелектролітах сульфату декстрану сульфату хітозану, що реагує на ph". Журнал харчової техніки 136: 1-8. Туонг, С. Д., Х. Лі та ін. (2008). «Хімічна фіксація багатошарів поліелектролітів на полімерних підкладках». Макромолекулярні дослідження 16 (4): Veerabadran, N. G., P. L. Goli, et al. (2007). "Нанокапсуляція стовбурових клітин у поліелектролітних багатошарових оболонках". Макромолекулярна біологія 7 (7): Wang, B., P. Liu, et al. (2008). "Дріжджові клітини зі штучною мінеральною оболонкою: захист та модифікація живих клітин шляхом біоміметичної мінералізації". Angewandte Chemie International Edition 47 (19): Yang, Y., Q. He, et al. (2007). "Зібрані альгінатні/хітозанові нанотрубки для біологічного застосування". Біоматеріали 28 (20): Замалєєва, А. І., І. Р. Шаріпова та ін. (2010). "Поліелектролітно-опосередкована збірка багатостінних вуглецевих нанотрубок на живих дріжджових клітинах". Ленгмюр 26 (4):
66 ГЛАВА 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ Суспензія клітин в ацетатному буфері (рН 3,8) Розчин білка (0,1%) β-лактоглобулін Альгінат натрію Змішування протягом 20 хв. (злегка протягом 1-2 годин при кімнатній температурі t) Очищення 0,1% [альгінату] в ацетатному буфері (рн 3,8) Розчин альгінату (0,01%) 2 промивки Фільтрувати розчин білка перед використанням Відфільтрувати розчин білка перед використанням Перемішування протягом 20 хв: Поліаніон-адсорбція 2 промиває Рисунок 15. Протокол інкапсуляції пошаровим методом 3. Характеристика інкапсуляції 3.1. Вимірювання дзета-потенціалу Електрофоретична рухливість μ дріжджових клітин та поліелектролітів вимірюється за допомогою зетаметра ZetaCompact від приладів компанії CAD. Вимірювання проводиться в прямокутному кварцовому каналі (5 х 2 х 70 мм). Застосовуючи електричне поле, негативно заряджена частинка рухається до анода і навпаки для позитивно заряджених. Потенціал ζ частинок обчислюється завдяки рухливості μ за допомогою закону Смолуховського (Senée et al., 2001). 49
78 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 61
79 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 62
80 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 63
81 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 64
82 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 65
83 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 66
84 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 67
85 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 68
86 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 69
118 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ з гіпотезою про те, що реакція відновлення дисульфідних містків за рахунок відновленого глутатіону більша в середовищі G +, оскільки концентрація глутатіону більша в середовищі G +, ніж у середовищі G. Ці результати дають змогу пояснити спостереження за дією відновленого глутатіону в G + дріжджах та окисленого глутатіону в G-дріжджах. Насправді суттєвої різниці в концентрації глутатіонредуктази не спостерігається у G-дріжджах відповідно до умов дегідратації. Це вказує на слабке втручання відновленого глутатіону в механізм реакції. На відміну від цього, зниження зниженого глутатіону в умовах дегідратації при 45 ° C пов’язане зі зменшенням концентрації глутатіонредуктази в G + дріжджах. 101
119 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ 5. Вплив інкапсуляції на стійкість дріжджів до зневоднення (Пункт 3) Виживання дріжджів покращилось після зневоднення при 45 С, коли клітини вирощували в середовищі G +. Поважаючи мету захисту дріжджів під час зневоднення, вважається, що пошарова інкапсуляція збільшує поліпшення виживання дріжджів. Крім того, вивчений вплив інкапсуляції на біохімічну модифікацію дріжджів в умовах зневоднення, щоб зрозуміти механізм захисту. Дріжджі капсулювали пошаровим методом. Три шари β-лактоглобуліну/альгінату/β-лактоглобуліну осідали по черзі на дріжджах завдяки електростатичним притяганням. Вивчали реакцію клітин, інкапсульованих чи ні, на умови дегідратації при 45 ° С. Поліпшення виживання дріжджів шляхом інкапсуляції спостерігалося після зневоднення. Крім того, результати інфрачервоної спектроскопії перетворення Фур'є джерела синхротрону частково пояснили механізм захисту. 102
127 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ Співвідношення амід I/Амід II для β-лактоглобуліну у розчині порівняно з зневодненими плівками (Ishida and Griffiths 1993). Це могло б пояснити сильні зміни аміду I/аміду II при навантаженнях PC1 1660 см -1 та 1575 см -1. Відмінності в інтенсивності білків, ліпідів та смуг полісахаридів між гідратованими та зневодненими клітинами можуть бути обумовлені кількістю води у зразках. (A) Регіон S3 (B) Регіон S4 гідратовані клітини зневоднені клітини гідратовані клітини зневоднені клітини Білки та ліпіди Амід II Білки та ліпіди Фосфатні смуги Полісахариди смуги OH Амід I Рисунок 4. Графіки оцінки PCA (фігури A & B) спектрів S-FTIR інкапсульованих та неінкапсульованих дріжджів до та після дегідратації в двох регіонах S3 та S4. Графіки оцінки PCA (рис. А і В); та графіки завантаження PCA (рис. C & D) PC1 проти ПК2. Діаграми балів показують дискримінацію між зразками. Діаграми навантаження вказують спектральну дисперсію всередині та між зразками. Результати PCA у двох великих регіонах S3 та S4 показали чіткі відмінності у реакції дріжджів на зневоднення. Для того, щоб більш точно спостерігати вплив процесу дегідратації на склад дріжджів, ми проаналізували спектри S-FTIR у конкретних регіонах, що містять інформацію про ліпіди та білки. Результати показані на малюнках 5 і 6. На малюнку 5 представлено друге похідне усереднених спектрів для інкапсульованих та некапсульованих клітин до і після процесу дегідратації при 45 С у конкретній області (від 110
24 години Час 15 хв при 25% відносної вологості та 25 C 15 хв при 25% відносної вологості та (час на вікнах ZnSe) 25 C (час на вікнах ZnSe) Рисунок 1. Використана експериментальна процедура та аналіз на зразках. Гідратовані та регідратовані клітини представляють як інкапсульовані, так і неінкапсульовані клітини до і після процесу дегідратації при 45 ° С. Для оцінки культивуваності клітин використовували КУО (колонієутворюючий блок). Для оцінки біохімічного складу клітин дріжджів використовували S-FTIR (Synchrotron FTIR microspectroscopy). Кінетика дегідратації та регідратації Saccharomyces cerevisiae BY4742 під час сушіння на повітрі була проілюстрована в попередньому дослідженні (Lemetais, Dupont et al. 2012). 116