Аналіз експресії генів у Ізумрудному попелу (Agrilus planipennis) з використанням кількісного реального

Резюме

Кількісна ПЛР у реальному часі (qRT-PCR) є ефективним інструментом для діагностики рівня мРНК у різних тканинах комах та стадіях розвитку. У цьому звіті ми демонструємо використання qRT-PCR для визначення рівнів мРНК у різних личиночних тканинах та стадіях розвитку інвазійних видів комах, смарагдового ясена.

Анотація

Смарагдовий ясен (EAB, Agrilus planipennis) - екзотичний інвазивний шкідник, який вбив мільйони ясенів (Fraxinus spp) у Північній Америці. EAB продовжує швидко поширюватися та атакувати ясени різного віку, від саджанців до дерев. Однак на сьогоднішній день для EAB існує дуже мало або взагалі відсутні молекулярні знання. Ми зацікавлені в розшифровці молекулярних основ фізіологічних процесів у тканинах, які допомагають ЕАБ у успішній колонізації ясенів. У цьому звіті ми показуємо ефективне використання кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-PCR) для вивчення рівнів мРНК на різних стадіях тканини личинки (включаючи жирове тіло середньої кишки та кутикулу) та різних стадіях розвитку (включаючи 1 St -, 2 Nd -, 3 Rd, 4-я стадія, передпліччя та дорослі) від EAB. Як приклад, ген перитрофіну (названий тут AP-PERI1) використовується як ген, що цікавить, а приклад рибосомного білка (AP-RP1) використовується як внутрішній контроль. Перитрофіни є важливими компонентами перитрофної мембрани/матриксу (ПМ), яка є оболонкою кишечника комах. ПМ виконує різні функції, такі як травлення та механічний захист епітелію середньої кишки.

Протокол

Повний протокол з різними кроками показаний на блок-схемі на малюнку 1. Окремі етапи формування дисекції, екстракції РНК, синтезу кДНК першого ланцюга та qRT-PCR описані нижче.

II. Вилучення РНК (відповідно до протоколу виробника щодо використання тризольного реагенту)

  1. Для початку вилучення РНК спочатку використовуйте пластикові пестики для гомогенізації тканин у тризолі за допомогою 1,5 мл пробірок Еппендорфа. Після гомогенізації доведіть загальний об'єм кожної проби до 1 мл за допомогою реагенту Trizol.
  2. На стадіях розвитку гомогенізуйте цілу тварину в рідкому азоті за допомогою маточки та ступки. Потім додають аліквоту гомогенату (50 мкг) до 1 мл тризолу.

  1. Інкубуйте пробірки для зразків з 1 мл тризолу протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.
  2. Після інкубації додайте 200 мкл хлороформу в кожну пробірку. Відразу після додавання хлороформу і енергійно струшуйте пробірки протягом приблизно 15 секунд. Потім протримайте пробірки при кімнатній температурі ще 2-3 хвилини.
  3. Далі центрифугують зразки при 12000 xg протягом 15 хвилин при 2 ° C. Після центрифугування РНК перебуває у водній фазі. Об'єм водної фази повинен становити 600 мкл, або 60% від загального об'єму тризолу.

  1. Обережно видаліть лише водну фазу. Присутність речовин нижче водної фази забруднює вилучену РНК. Потім переносять водну фазу у відповідну мітку 1,5 мл пробірки Еппендорфа.
  2. Для осадження РНК з водної фази змішують 0,5 мл ізопропілового спирту в кожну пробірку. Інкубуйте зразки при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Після інкубації центрифугують при 12000 xg протягом 10 хвилин при 2 ° C.

  1. Після центрифугування викиньте супернатант з пробірок. РНК утворюється в гелеподібній гранулі на дні трубки. Промийте гранулу 75% етанолом, додаючи принаймні 1 мл 75% етанолу на 1 мл тризолу. Змішати на вихорі. Потім центрифугують при 7500Xg протягом 5 хвилин при 2 ° C.

  1. Викиньте супернатант з пробірок. Знову центрифугуйте в маленькій настільній центрифузі протягом 1 хвилини. Видаліть надлишок супернатанту з пробірки, обережно піпетуючи. Залиште пробірку відкритою і дайте гранулі висохнути на повітрі протягом 5-10 хвилин. Переконайтеся, що у вас є сухі гранули, оскільки це значно зменшить їх розчинність.
  2. Після сушіння на повітрі гранулу в обробленій водою діетилпірокарбонаті або DEPC. Кількість води, яка використовується для ресуспендування гранули, залежить від розміру гранули. Використовуйте 50 мкл води, обробленої DEPC, для невеликих гранул або 100 мкл для великих гранул. Дозвольте гранулі повністю розчинитися у воді, обробленій DEPC, кілька разів посунувши кінчик піпетки вгору та вниз.
  3. Як тільки гранула розчиниться, помістіть зразок при 55 ° C на 10 хвилин.
  4. Потім вимірюють концентрацію кожного зразка РНК за допомогою спектрофотометра Nanodrop (2 мкл зразка РНК).
  5. Зберігайте зразки РНК при -80 ° C до подальшого використання.

III. Синтез кДНК першої нитки (відповідно до протоколу виробника з набором синтезу першої нитки SuperScript від Invitrogen.)

Дизайн праймерів та визначення еталонного гена

    Дизайн грунтовки з температурою плавлення (Tm) 60 ° C і розміром продукту

100 п.н.

  • AP-PERI1 використовується як ген, що представляє інтерес для цього експерименту. Для подальшого аналізу та нормалізації даних необхідний контрольний ген або система внутрішнього контролю. Рибосомний білок (AP-RP1) використовується як еталонний ген для цього експерименту.
  • Приготуйте 5um робочих запасів праймерів, які будуть використовуватися, включаючи ваш контрольний ген.

    • Підготовка стандартів

    1. Для розрахунку ефективності праймерів повинні бути використані стандарти.
    2. Зробіть суміш кДНК з різних зразків, що тестуються.
    3. Зробіть 5-кратне послідовне розведення для будь-якої точки на графіку. Досить бути чотирьох розведень, але настійно рекомендується п’ять.
    4. Обсяг варіюється залежно від того, скільки балів і скільки технічних копій використовується. Достатньо скласти стандарт для кожного тестуваного гена з відповідним еталонним геном.

    1. Шаблон конструкції показує назву зразка для кожної лунки на планшеті qRT-PCR. Пам’ятайте, що існують стандарти для кожного гена і принаймні дві технічні копії на зразок.

    Налаштування параметрів колеса

    1. Увімкніть машину qRT-PCR та введіть параметри колеса. Параметри ПЛР для цього експерименту такі:
      Крок 1:
      • 1 цикл: 95 ° C 3 хв
      Крок 2:
      • 40 циклів: 95 ° C 15 с, а потім 60 ° C 30 с
        (Необов’язково: включіть такі кроки для визначення кривої плавлення)
      Крок 3:
      • 1 цикл: 95 ° C 1 хв
      Крок 4:
      • 1 цикл: 55 ° C 1 хв
      Крок 5:
      • 81 цикл: 55 ° C 30 сек

    Налаштування пластини для машини CFX96 (BioRad)

    V. Схематичне зображення експерименту

    аналіз
    Ілюстрація 1: Блок-схема, що показує послідовність кроків для вивчення експресії генів.

    ізумрудному
    Малюнок 2: А) Розсічення личинки EAB показує середню кишку посередині. Б) ізольована середня кишка личинок EAB

    аналіз
    Малюнок 3: А) Середні значення відносної експресії (обертів) для гена перитрофіну (AP-PERI1) у різних стадіях личинкової тканини, включаючи кутикулу (Cu), середню кишку (MG) та жирове тіло (FB). ЕАБ-специфічний рибосомний білок (названий тут AP-RP1) був використаний як внутрішній контроль для нормалізації даних, отриманих для гена, що представляє інтерес, AP-PERI1. Б) Відносна зміна складки AP-PERI1 в личинкових тканинах. Тканина кутикули виявляла найменшу експресію, і тому її використовували як калібрувальний (1Х) зразок (Pfaffl, 2001).

    експресії
    Малюнок 4: A) Середні значення відносної експресії (обертів) для гена перитрофіну (AP-PERI1) на різних стадіях розвитку EAB, включаючи стадії личинок (1-й, 2-й, 3-й і 4-й), препупії (PP) та дорослі особини (A). Визначений EAB рибосомний білок (AP-RP1) був використаний як внутрішній контроль для нормалізації даних, отриманих для гена, що представляє інтерес, AP-PERI1. Б) Відносна зміна складки AP-PERI1 на різних стадіях розвитку. Зразок РР показав найнижчий рівень рівня мРНК, і тому його взяли як калібратор (1Х зразок).

    Кількісна ПЛР у реальному часі (qRT-PCR) є ефективним інструментом для діагностики рівня мРНК у різних тканинах комах та стадіях розвитку. Крім того, qRT-PCR має переважно центральний інструмент для перевірки даних, отриманих за допомогою аналізів експресії генів з високою пропускною здатністю, таких як мікрочипи та нове покоління РНК-Seq.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Значення порогових циклів (Ct) для кожного зразка отримують на планшеті qRT-PCR. Для отримання стандартної кривої значення Ct, отримане для кожного розведення, будували графіком щодо логарифму концентрації. Потім значення Ct для експериментальних зразків будували на цій стандартній серії розведення кривої. Цільові кількості були розраховані на основі окремих стандартних кривих, сформованих для кожного експерименту, тобто експресії тканини та розвитку. Потім відносні значення виразів (обертів) визначали діленням суми цільової послідовності, що представляє інтерес (в даному випадку AP-PERI1), та суми, отриманої для системи внутрішнього контролю (AP-RP1). Важливим для розрахунків, журнали REV для кожного гена були проаналізовані ANOVA (дисперсійний аналіз), використовуючи процедуру PROC MIXED від SAS (SAS Institute Inc., SAS/STAT User Guide, Версія 9.1). Значення виразу вимагалося на p Subscription. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Жодних конфліктів інтересів не заявлено.

    Подяка

    Ми визнаємо допомогу, яку надала дельта Лурду Арруета Антекера (Департамент ентомології, Університет штату Огайо/OARDC, Вустер, штат Огайо) у організації експериментів. Ми дякуємо Dr. Тереза ​​Польща (USDA, Forest Services, NRS) для відправки зразків личинок EAB. Довідка, надана Dr. Luis A Canas та Nuris M Acosta з мікроскопом мають високу оцінку. Фінансування цього проекту було забезпечено державними та федеральними коштами Центру досліджень та розвитку сільського господарства штату Огайо, Університету штату Огайо.