Дефіцит імунопротеасомної субодиниці lmp7 покращує ожиріння та порушення обміну речовин - повідомляє

субодиниці

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • LMP7-дефіцитні миші стійкі до HFD-індукованого ожиріння
  • LMP7-дефіцитні миші стійкі до метаболічних порушень, спричинених HFD
  • Дефіцит LMP7 не впливає на споживання їжі, рухову активність та витрати енергії
  • Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів
  • LMP7 у кістковому мозку та інших клітинах, крім кісткового мозку, сприяє розвитку ожиріння
  • Дефіцит LMP7 послаблює запальні реакції в жировій тканині
  • Обговорення
  • Методи
  • Тварини
  • Мікро-КТ аналіз
  • Біохімічний тест
  • GTT та ITT
  • Гістологія та імуногістохімія
  • RT-PCR-аналіз у реальному часі
  • Досвід BMT
  • Аналіз дихальних та рухових газів
  • Збір фекалій та екстракція ліпідів калу
  • Проточний цитометричний аналіз
  • Досвід в пробірці
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • коментарі

Теми

  • Ендокринна система та метаболічні захворювання
  • Метаболічний синдром
  • Ожиріння

Анотація

вступ

Результати

LMP7-дефіцитні миші стійкі до HFD-індукованого ожиріння

( А - С ) Рівні TCHO в сироватці крові, TG ( AT ), рівень цукру в крові ( ) та сироватковий інсулін ( VS ) у мишей WT та LMP7 -/- при нормальному харчуванні та HFD (n = 8–12). ( D, E ) Результати GTT ( D ) та ІТТ ( Е ) у WT та LMP7 -/- мишей на нормальних дітях та HFD (n = 8 для кожного). Дані виражаються як середнє значення ± SEM. * p -/- За нормальної дієти або нормальної серцевої підготовки (рис. 3А) ми вимірювали рухову активність та витрати енергії в обох штамах, щоб оцінити різницю в базальних показниках метаболізму. Суттєвих відмінностей у руховій активності, поглинанні кисню (VO 2), коефіцієнті дихального обміну (RER), споживанні вуглеводів (CH) та споживанні жиру (FAT) між WT та LMP7 -/- мишами при нормальному харчуванні їжею або годувати. (Рис. 3B, C). Підтверджуючи цей результат, хоча експресія Ucp1 (відокремлюючий білок 1 або термогенін) була збільшена в коричневій жировій тканині за допомогою дієти HFD, не було суттєвої різниці в його експресії між WT та LMP7 -/- (дані не наведені).

( AT ) Споживання їжі у мишей WT та LMP7 -/- с a нормальна дієта (n = 7–8) та СНВ (n ​​= 13–14). ( ) Рухова активність у мишей WT та LMP7 -/- при нормальному харчуванні та HFD (n = 8 для кожного). ( VS ) Дані про витрати енергії. VO 2, RER, CH та FAT у мишей WT та LMP7 -/- при нормальному харчуванні та HFD (n = 8 для кожного). Дані виражаються як середнє значення ± SEM.

Повнорозмірне зображення

Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів

Обговорення

Основними висновками цього дослідження є наступні: (1) дефіцит LMP7 зменшує накопичення жиру, спричиненого HFD, і захищає від ожиріння; (2) Дефіцит LMP7 покращив непереносимість глюкози та чутливість до інсуліну, а також метаболізм ліпідів та глюкози (3) не було різниці у споживанні їжі, руховій активності та енергетичних витратах між мишами WT та/або LMP7; (4) Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів; (5) Експерименти BMT показали, що LMP7 у клітинах, одержаних з кісткового мозку, та клітинах, що не походять від кісткового мозку, сприяє розвитку ожиріння, спричиненого HFD; (6) Дефіцит ЛМП зменшував запальні реакції, такі як інфільтрація макрофагів та експресія хемокінів, водночас збільшуючи продукцію адипонекції. Результати цього дослідження дозволяють припустити, що LMP7 сприяє запальним реакціям, індукованим макрофагами в жировій тканині, та розвитку ожиріння та метаболічних порушень. Наскільки нам відомо, це дослідження дає перші докази того, що LMP7 відіграє важливу роль у розвитку ожиріння та порушення обміну речовин.

Зростаюча кількість доказів вказує на те, що запалення відіграє важливу роль у розвитку ожиріння та порушення обміну речовин 1, 2. Хоча низка звітів описують роль запалення в їх процесі, недостатньо добре зрозуміло, як відбувається запалення та регулюється. Хоча імунопротеасома відіграє важливу роль у презентації антигену MHC класу I, останні дослідження показали, що LMP7 необхідний для продукування прозапальних цитокінів, таких як TNF-α та IL-6, а також для прогресування експериментального артриту та коліту 5, 6. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що дефіцит LMP7 гальмує запалення, ожиріння та порушення метаболізму жирової тканини: це свідчить про те, що інгібування LMP7 має потенціал для профілактики та лікування ожиріння та метаболічних розладів LMP7. Дійсно, кілька експериментальних досліджень показали, що селективний інгібітор LMP7 ONX-0914 є суттєво ефективним при лікуванні експериментального артриту та коліту 5, 6. Таким чином, вплив цього інгібітора LMP7 на ожиріння та порушення обміну речовин ще слід дослідити у майбутніх дослідженнях.

Ми показали, що дефіцит LMP7 зменшує експресію ліпази підшлункової залози, збільшує вміст ліпідів у калі та інгібує підвищення рівня ТГ у плазмі крові при пероральному введенні олії або HFD. З іншого боку, рівень глюкози та інсуліну в сироватці крові у мишей LMP7 -/- на нормальній дієті Чау не впливав. Непереносимість глюкози та чутливість до інсуліну покращились у мишей LMP7 -/-. Таким чином, LMP7 впливає на функцію зовнішньої та внутрішньої секреції підшлункової залози та бере участь у травному та гормональному гомеостазі, що має важливе значення для метаболічного статусу мишей.

На закінчення ми чітко показали, що дефіцит LMP7 інгібує індуковане макрофагами запалення в жировій тканині та покращує розвиток ожиріння та метаболічних порушень у мишей, яких годували HFD. На основі наших результатів ми припускаємо, що дефіцит LMP7 пригнічує запалення жирової тканини, інгібуючи індукцію прозапальних цитокінів у макрофагах та адипонекцію, що виробляється адипоцитами. Крім того, LMP7 впливає на функцію зовнішньої та внутрішньої секреції підшлункової залози. Це дослідження не тільки демонструє, що LMP7 може бути потенційною терапевтичною мішенню для профілактики та лікування ожиріння та метаболічних розладів, але також надає нову інформацію про механізм, що лежить в основі патофізіології цих розладів.

Методи

Тварини

Усі експерименти на тваринах були схвалені Експериментальним комітетом з використання та догляду за тваринами Керівництва для лабораторних тварин Медичного університету Джічі та проводились згідно з керівництвом Медичного університету Джічі. Мишей C57BL/6J WT було придбано у Japan SLC, Inc. (Хамамацу, Японія). Миші LMP7 -/- вже описані 4. Самців мишей (9-10 тижнів) годували або 60 ккал% HFD (дослідницькі дієти: D12492, Японія LSG, Токіо), або стандартними продуктами харчування (CE-2; CLEA Japan Inc., Осака). Кожну мишу зважували кожні 2 тижні. У кінцевих точках мишей голодували протягом 6 год, повторно зважували і брали кров для отримання сироватки. Після перфузії тканини ретельно вирізали і зважували.

Мікро-КТ аналіз

Мікро-КТ-аналіз проводили за допомогою LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Токіо, Японія). М’язову, вісцеральну та підшкірну жирову масу аналізували за допомогою програмного забезпечення LaTheta (Hitachi Aloka Medical).

Біохімічний тест

Кров брали з хвостової вени 6 годин голодуючих мишей. Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою вимірювача глюкози в крові Terumo MEDISAFETM (Terumo Co., Токіо, Японія). Рівні TCHO і TG у сироватці крові або плазмі крові вимірювали за допомогою системи FUJI DRI-CHEM (Fujifilm, Токіо, Японія). Рівні інсуліну, адипонектину та лептину в сироватці крові вимірювали за допомогою наборів ІФА (Sibayagi, Gunma, Японія; R & D Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота; та BioVendor R & D, Брно, Чеська Республіка).

GTT та ITT

GTT проводили у мишей на стандартному харчуванні або HFD протягом 8 тижнів. Миші голодували за 6 годин наперед, маючи вільний доступ до води. Потім глюкозу в крові вимірювали безпосередньо перед ін’єкцією внутрішньочеревної глюкози (1 г/кг маси тіла у сольовому розчині), потім через 15, 30, 60, 90 та 120 хвилин після введення. ITT проводили подібним чином шляхом введення ін’єкції інсуліну (0,75 ОД/кг маси тіла) замість глюкози.

Гістологія та імуногістохімія

Фарбування ВІН та імуногістохімія для F4/80 та LMP7 проводили, як описано раніше 4, 23 .

RT-PCR-аналіз у реальному часі

Загальну РНК готували з нирки з використанням ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Тояма, Японія) відповідно до інструкцій виробника. RT-PCR-аналіз у режимі реального часу проводили за допомогою системи виявлення кісток термоциклеру PCR Takara TP960 (Takara Bio Inc., Шига, Японія) для виявлення експресії мРНК, як описано раніше 23. Експресія генів нормалізувалася за допомогою експресії Actb (β-актину) за допомогою програмного забезпечення, що постачається разом із системою. Праймери, що використовуються для аналізу RT-PCR, перелічені в додатковій таблиці S1.

Досвід BMT

Мишей BMT генерували, як описано раніше 24. Для перевірки відновлення кісткового мозку після трансплантації відповідно до цього протоколу ми використовували мишей із зеленим флуоресцентним білком (GFP) як донорів. Проточний цитометричний аналіз показав, що через 8 тижнів після ТМО клітини периферичної крові мали понад 90% GFP-позитивних клітин 24. За допомогою цього протоколу ми створили 3 типи мишей BMT: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- миші).

Аналіз дихальних та рухових газів

Мишей розміщували індивідуально в метаболічній камері на 48 год, щоб дозволити їм адаптуватися до навколишнього середовища та досягти постійного коефіцієнта дихального обміну (RER). Аналіз дихальних газів (O 2 і CO 2) проводили за допомогою системи аналізу метаболічних газів з відкритим контуром, підключеної безпосередньо до мас-спектрометра (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Японія). Споживання кисню (VO 2) та вироблення вуглекислого газу (VCO 2) вимірювали кожні 5 хвилин для кожної клітки (одна миша). RER розраховували як співвідношення VCO 2/VO 2. Загальне споживання вуглеводів (CH) та жиру (FAT) розраховувались за допомогою стехіометричних рівнянь Фрейна, як показано: CH = 4,51 × VCO 2 - 3,18 × VO 2 [мг/хв] та FAT = 1,67 × (VO 2 - VCO 2) [ мг/хв]. Рухову активність визначали кожні 5 хвилин для кожної камери (одна миша) за кількістю інфрачервоних променів, перерваних у напрямках X та Y за допомогою системи контролю активності (ACTIMO-100; Shinfactory, Фукуока, Японія), пов’язаної з окремими метаболічними камерами.

Збір фекалій та екстракція ліпідів калу

Фекалії мишей, яких годували HFD і утримували їх окремо протягом 24 год, збирали і сушили вакуумним центрифугуванням. Висушений кал зважували і подрібнювали в ступці. Подрібнений кал переносили в скляну пробірку і повторно зважували. Ліпіди екстрагували за допомогою хлороформу: метанолу (2: 1) двічі за методикою Фольха 25 і зважували. Вміст жиру розраховували як% від маси подрібнених фекалій.

Проточний цитометричний аналіз

Інфільтруючі лейкоцити в епідидимальній ВАТ аналізували за допомогою проточної цитометрії, як описано раніше 11. Дані проточної цитометрії отримували за допомогою FACSVerse (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія) та аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA). Реагенти, що використовуються для проточного цитометричного аналізу, перелічені в додатковій таблиці S2.

Експерименти in vitro

Перитонеальні макрофаги миші культивували в RPMI1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) та 1% антибіотиком - антимікотиком (Invitrogen, Carlsbad, CA) з використанням 24-лункових планшетів. Через 48 год клітини стимулювали 400 мкМ пальмітату (10% BSA) 26 протягом 24 год. Рівні IL-1β, IL-6 та TNF-α у супернатантах визначали за допомогою наборів ELISA (R&D Systems Inc.).

статистичний аналіз

Результати з нормальним розподілом аналізували параметричним неспареним t -тестом. Результати без нормального розподілу аналізували за допомогою критерію Манна - Уітні, критерію Крускала - Уолліса або поздовжнього аналізу. Всі аналізи проводились із використанням програмного забезпечення Stata, випуск 13 (Stata Corp., College Station, TX). P -значення