ДЕМОКРАТИЧНА І НАРОДНА РЕСПУБЛІКА АЛЖИР - PDF Завантажити безкоштовно

ا لجمھوریة الجزاي ریة الدیمقراطیة الشعبیة ДЕМОКРАТИЧНА РЕСПУБЛІКА АЛЖИР НАРОДУ وزارة التعلیم العالي و البحث العلمي МІНІСТЕРСТВО ВИЩОЇ ОСВІТИ І НАУКОВИХ ДОСЛІДЖЕНЬ جامعة الاخوة منتوري університет Mentouri Костянтин كلیة علوم الطبیعة و الحیاة факультет відділу природи і життя: Біохімія/Клітинна і молекулярна біологія Дисертація на з метою отримання диплому магістра Сфера: природничі та біологічні науки Сектор: біологічні науки Спеціальність: біохімія/протеомічний аналіз та охорона здоров'я Тема: Дослідження дріжджів, що виробляють термостабільні екзоцелюлярні гліколітичні ферменти: Виробництво (в чашці Петрі та в партії) та характеристика вироблені ферменти. Представлено та підтримано: DALI Nadine Sofia На: 28.06.2016 HAMAME Afaf Журі оцінки: Президент журі: BENHAMDI A.C.C., Université Frères MENTOURI Constantine. Науковий керівник: MERAIHI Z. Професор, Університет Фрера MENTOURI Костянтин. Співруководитель: DAKHMOUCHE S. M.A.A., ENS, Університет Костянтина 3. Екзаменатор: БЕННАМУН Л. М.А.А., Університет Фрер MENTOURI Костянтин. Навчальний рік: 2015-2016

Подяка Спочатку ми хотіли б подякувати Богові, Всевишньому, за те, що він дав нам волю і терпіння завершити цю роботу, здійснену на факультеті природничих та біологічних наук Університету Frères Mentouri Constantine. З великим задоволенням ми хотіли б висловити свою подяку професору Мерайхі З, нашому наставнику, який керував цією роботою, підтримував нас і підштовхував до того, щоб перевершити себе і дати найкраще від себе завдяки її конструктивній та обгрунтованій критиці. Велика подяка також висловлюється нашому співнаглядачу доктору Джекріфу-Дахмуче С. та пані Беннамун, яка справді допомогла нам своїми цінними порадами. Ми щиро дякуємо також членам журі, які погодились оцінити цю роботу: доктору Бенхамді А. за велику честь головувати в журі. Пані Беннамун Л. Помічнику магістра в У. Фрере Ментурі за те, що вона люб’язно вивчила цю роботу. Дякуємо всім викладачам, які викладали нас під час нашого університетського курсу, зокрема професорам Мечакрі та професору Хеліфі, а також усім людям, які прямо чи опосередковано брали участь у здійсненні цієї роботи.

Присвяти Я присвячую цю скромну працю, перш за все своїм дорогим батькам за всі ці роки жертв, Тобі тату, який завжди довіряв мені і штовхав мене віддавати найкраще від себе, Тобі мамо, яка навчила мене, що наполегливість завжди закінчується платячи і хто завжди вірив у мене і дав мені найкращу освіту, моєму братові Маліку та сестрі Серін за їх любов, моїм бабусям, а також тій, яка піклувалася про мене з маленької Мма., тітки, кузени, двоюрідні брати та всі члени сім'ї. Велике спасибі Сандрі та Селії, які мені дуже допомогли. Всім моїм друзям, які підтримали і допомогли мені; Джихене, Інес, Самі, Абду, Юсеф і Рахім. Для тієї, що я хотів би, щоб вона була з нами сьогодні, щоб поділитися зі мною цією радістю "Ламія", що Бог вітає її у своєму величезному раю. Надін Софія, DALI

Присвяти На згадку про моїх батьків, котрі благословили моє бажання вчитися і завжди підбадьорювали мене, з усією моєю любов’ю та вдячністю за те, що я став тим, що я є, хай Бог дарує їм здоров’я та довгих років життя. Моїй матері «Моє джерело ніжності та мужності, сяйво мого успіху». Моєму батькові “Сильне плече, уважне уважне око і людина, найдостойніша моєї поваги та поваги”. Моєму братові Акраму та моїм сестрам мою довірену Райєне, мою маленьку принцесу Інсаф, яку вони знаходять тут свідченням моєї глибокої ніжності . Моїм дуже дорогим бабусям і дідусям, моїм дядькам Набілу та Чавки, нехай вони знайдуть тут вираз моїх найщиріших почуттів до прихильності та підтримки, які вони виявили мені у важкі часи. Моїм дуже дорогим друзям, котрі знали, як посипати радість і щастя в моєму серці: Латіфа, Сара, Лейла, Бадра, Інес, Сафа, Каміль, Аміна, Ямін, Ібтісем, Бесма, Сусу. Мої найвизначніші присвяти Дуду, Рімелю, Самі, Чахеру. Цю скромну роботу я присвячую геніальній особистості, яка стала для мене джерелом натхнення як з точки зору його якостей, так і кар’єри, явно йдеться про Мішеля Депашерера, який завжди підтримував мене в житті. Хамаме Афаф.

Загальне вступ Основною метою цього дослідження є відбір дріжджів, що продукують два термостабільних амілолітичних ферменту; α-амілаза та мальтаза з неочищеного екстракту та їх характеристика (рН, температура та термостабільність). Дріжджі ізольовані в екологічній ніші в екстремальних умовах (тверда пшениця, що зберігається в Біскра-Сахара-Південний Алжир). Виробництво здійснюється на оптимізованому середовищі на основі сироватки. Це дослідження включає першу частину, присвячену переліку знань про дріжджі, ферменти та середовище виробництва: сироватка. Друга частина містить методи та методи, нарешті, остання частина підсумовує результати та їх обговорення. 2

Бібліографічний підсумок Pseudomycellium true mycelium Рисунок 01: Філаментація дріжджів (Guiraud, 1998) (a) (b) Рисунок 02: Розмноження в Clavispora lusitaniae ABS7; (а) безстатеві за бутонізацією (культура на середовищі YPGA) та статеві з утворенням асків з 2 і 4 спорами. (Djekrif, 2016). 4

Бібліографічний підсумок Рисунок 3: Філогенне дерево родів дріжджів (Scannell et al., 2007). 1.6. Біотехнології та дріжджі Більшість дріжджів відносяться до типу GRAS (загальновизнаним як безпечний) за їх нешкідливість, як Saccharomyces cerevisiae (Leveau, Bouix, 1993). На додаток до різноманітного метаболізму, ці мікроорганізми займають важливе місце в харчовій промисловості, вони беруть участь у розробці багатьох харчових продуктів, виробництві промислових ферментів (табл. 2), паливному етанолі та одноклітинних білках для їжі. Тварина (Саймон та Meunier, 1970) гліцерин, а також певні розчинники, вітаміни, вакцини та каротиноїди (Jacob, 1997 та Buzzini, 2000); а також переробці сільськогосподарських відходів (Scriban, 1984 та Lecterc et al., 1995). Біотехнології та біомедичні дослідження також використовують ці мікроорганізми (Mattanovich et al., 2012) для виробництва молекул, що представляють медичний інтерес (Johnson and Echavarri -Erasum, 2011) (Таблиця 3). 9

Синтез літератури Таблиця 3: Деякі ферменти та рекомбінантні білки, синтезовані дріжджами, що використовуються в терапії. Типи ферментів Код Дріжджі Патологія для лікування α-амілази EC 3.2.1.1 Saccharomyces carlgergensie Aide Saccharomyces cerevisiae травна література Wong et al., 2002 Бетаглюкозидаза EC 3.2.1.21 Clavispora lusitanie Хвороба Гоше Ламерс та ін., 2016; Regenboog et al., 2016 Глюкоза-6-фосфат EC 1.1.1.49 Saccharomyces cerevisiae Favism (Loiudice et al., 2001) дегідрогеназа (G6PD) Гемоглобін _ Pichia pastoris Анемія Thalassemia Huaxin et al., 2007 Ліпази EC 3.1.1.3 Candiday lipolyt marxianus Засіб для травлення Sikandar et al., 2010 та Deive et al., 2003 Білкові вакцини _ Sporidiobolus Запобігання інфекціям. Bitter et al., 1984 Blin., 2002 12

Резюме літератури (a) (b) Рисунок 10: Механізм аномерної конфігурації мальтази: (a) механізм інверсії; (b) механізм утримання. (Henrissat et al., 1995; Davies et al., 1995; S. Maicas et al., 2016; D. H. Kwan et al., 2016). 2.2.4. Фізико-хімічні характеристики Мальтази відрізняються типом їх субстратів, наприклад, у таких мікроорганізмів, як Thermus caldophilus, фермент гідролізує невідновлювальну функцію α-1,6-глікозидного зв’язку ізомальтосахарози та панози, зв’язок α-1,3 -глікозидні з наступних оз: нігероза та тураноза відповідно (Oyekanmi Nashiru et al., 2011) та α-1,2-глікозидний зв’язок сахарози (Majzlová et al., 2013). Α-Глюкозидаза, яка має широкий діапазон специфічних субстратів, повідомляється від Bacillus sp, який діє на α-1-глюкозидне зв’язування α-трегалози, а також на α-1,3 та α-1,4 ланки та α- 1,6 та α-1,2 із нігерози, мальтози, ізомальтози, 1-O-арил-α-глюкозидів відповідно (Oyekanmi Nashiru et al., 2001). Молекулярні механізми, що призводять до мультиспецифічності розпізнавання субстрату, є результатом амінокислотної послідовності активного центру ферменту (Oyekanmi Nashiru et al., 2001). 29

Резюме літератури Рисунок 12: Спосіб дії пектиназ PMGL: поліметилгалактуронат-ліаза; ПМГ: поліметилгалактуроназа; PE: пектинестераза; PGL: полігалактуронат ліаза; PG: полігалактуроназа. (Kouhounde et al., 2014). Різні види дріжджів, що виробляють полігалактуроназу, використовуються промислово для поліпшення якості фруктових соків, такі як: Rhodotorula, Saccharomyces, Candida, Cryptococcus і Geotrichum, цитуються декількома авторами (Merín María Gabriela et al., 2015; Naumov et al., 2016; Pagani et al., 2016; Belda et al., 2016; Moubasher et al., 2016). У таблиці нижче представлені фізико-хімічні властивості деяких полігалактуроназ. Таблиця 11: Фізико-хімічні властивості деяких полігалактуроназ (ПГ). Джерело Природа PM Pi AE (U) T op (C) ph op Пліснява Aspergillus japonicus EndoPG 38 5,6 30 [4-5,5] Aspergillus oryzae EndoPG 41 - - 45 5 Aspergillus niger EndoPG 61 582 43 [3.8-4.3] Aspergillus awamori EndoPG 41 6,1 487 40 5 Aspergillus alliaceus ExoPG 40 5,9 35 5,5 Дріжджі Saccharomyces cerevisiae EndoPG 39-2870 45 5,5 Rhodotorula dairenensis EndoPG 40 - - 12 3,5 Saccharomyces uvarum EndoPG 20 - - 29 5 Candida haemulonii EndoPG - - -

Підсумок літератури Таблиця 13: Хімічний склад сироватки (Alais, 1981) Параметри Солодка сироватка (г/л) Кислотна сироватка (г/л) Кислотність 13,83 1 67,16 1 Вологість 93,5 2 93 2 Суха речовина 55 75 55 65 Зола 4 6 6 8 Лактоза 40 57 40 50 Загальна азотиста речовина 7 11 4,8 10,5 Жир 0 5 0 2 Молочна кислота 0 0,3 7 8 Хлорид 2,3 2,9 2,0 2,2 Кальцій 0,4 0,6 1,2 1,4 Фосфор 0,4 0,7 0,5 0,8 Калій 1,4 1,6 1,2 1,5 (1): ДОРНІЧНА ступінь. (2):% 39

Матеріал і методи

Матеріали та методи Абсорбція при 650 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 2,165x R² = 0,999 0 0,2 0,4 0,6 Концентрація [мг/мл] Рисунок 15: Стандарт білка кривої. 5. Вивчення властивостей α-амілази та мальтази сирого екстракту 5.1. Вплив рН Вплив рН на активність визначають у діапазоні рН [3 - 7] з варіаціями 1 одиниці, використовуючи цитратний та фосфатний буфери: лимонна кислота (0,5 М)/двоосновний фосфат натрію (0,5 М): для рН 3 та ph 4. Монокалієвий фосфат (M/15)/динатрію фосфат (M/15) для ph 5, ph 6 та ph 7. Ця маніпуляція дозволяє визначити оптимальну рН. 5.2. Вплив температури Вплив температури інкубації вивчають у діапазоні від 40 до 100 С (з кроком 10 С) шляхом вимірювання ферментативної активності неочищеного екстракту, витриманого протягом 30 хв при оптимальному рН. 5.3. Термічна стабільність Залишкова активність ферменту оцінюється у 70, 80, 90 та 100 C кожні 30 хв протягом 120 хвилин. Крива активності ферменту в залежності від часу дозволяє розрахувати період напіввиведення ферменту для кожної досліджуваної температури. 6. Статистична обробка Криві та таблиці були створені з використанням програмного забезпечення Excel (2007). 44

Результати і обговорення

Результати та обговорення 1. Пересадка штамів та відбір дріжджів з кращим зростанням (a) (b) Рисунок 16: Пересадка чотирьох штамів дріжджів T, L1, L5 та L10, виділених із пшениці із посушливих екосистем (Південний Алжир, Біскра), макроскопічний вигляд після 48 годин інкубації при 4 ° C. (а): T, L1 та L10 на середовищі YPGA; (b): L5 на КПК та носії Сабуро. Чотири випробувані штами: L1, L5, L10 і T (ізольовані із посушливих екосистем, регіон Біскра, Південний Алжир) культивують при температурі 40 ° C на середовищах для пересадки та збереження: YPGA, PDA та Sabouraud, загальним субстратом яких є 2% глюкози, як єдине джерело вуглецю для росту дріжджів. Штами L5 і L10 демонструють хороший ріст, тоді як штами L1 і T демонструють досить слабкий ріст після кількох днів тестування. Отже, штам L5 та L10 відбирають для скринінгового тесту, щоб вибрати найбільш ефективний штам для виробництва ферментів: α-амілази, мальтази, пектинази, целюлази та мальтази. Згідно з лабораторною ідентифікацією, штами L5 і L10 відносяться до дріжджів Clavispora lusitaniae. 45

Результати та обговорення Таблиця 14: Демонстрація ферментативної активності штаму L10 на твердому та специфічному середовищі через 48 годин інкубації при різних температурах. (YPMA: екстракт дріжджового пептону - мальтоза-агар; YPSA: екстракт дріжджового пептону-крохмаль-агар; YPPA: екстракт дріжджового пептону-пектин-агар; YPCA: екстракт дріжджового пептону-целюлоза-агар та казеїновий агар). C YPSA YPMA YPPA YPCA Казеїновий агар 40 42 45 47 50 47

Результати та обговорення Таблиця 15: Демонстрація ферментативної активності штаму L5 на конкретних середовищах після 48 годин інкубації при різних температурах. (YPMA: екстракт дріжджового пептону-мальтози-агар; YPSA: екстракт дріжджового пептону-крохмаль-агар; YPPA: екстракт дріжджового пептону-пектин-агар; YPCA: екстракт дріжджового пептону-целюлоза-агар та казеїновий агар). C YPSA YPMA YPPA YPCA Казеїновий агар 40 42 45 47 50 48

Додаток 1: Середовище для субкультури та збереження штамів o YPGA (дріжджовий екстракт пептон-глюкозний агар), що використовується для збереження штаму. Він містить глюкозу як джерело вуглецю. - Дріжджовий екстракт: 5 г - Пептон: 10 г - Глюкоза: 20 г - Дистильована вода: 1000 мл PDA (картопляний декстрозний агар) Використовується для адаптації штаму до крохмалю. - Картопляний екстракт: 1000 мл - Глюкоза: 20 г - Агар: 20 г. Приготування картопляного екстракту: 200 г неочищеної картоплі, промитої та нарізаної дрібними кубиками доводять до кипіння в літрі дистильованої води протягом 1 години. Потім їх подрібнюють, фільтрують і витягнутий екстракт доливають до одного літра дистильованої води. o Sabouraud Пляшка із середовищем Sabouraud об'ємом 200 мл поставлена лабораторією Пастера в Алжирі. - Дистильована вода: 1000 мл - Глюкоза: 20 г - Агар: 15 г - Пептон: 10 г

Додаток 2: Носії для демонстрації ферментативної активності o YPMA (дріжджовий пептон-мальтозний агар) - екстракт дріжджів: 15 г - пептон: 20 г - мальтоза: 20 г - агар: 20 г - дистильована вода: 1000 мл o YPSA (дріжджовий пептон-крохмальний агар) - екстракт дріжджів: 15 г - Пептон: 20 г - Крохмаль: 20 г - Агар: 20 г - Дистильована вода: 1000 мл o YPPA (Дріжджовий пептоновий агар) - Дріжджовий екстракт: 15 г - Пептон: 20 г - Пектин: 20 г - Агар: 20 г - Дистильована вода: 1000 мл o YPCA (Дріжджовий пептонцелюлозний агар) - Дріжджовий екстракт: 15 г - Пептон: 20 г - Целюлоза: 20 г - Агар: 20 г - Дистильована вода: 1000 мл o Казеїновий агар - Казеїн: 100 г - Агар: 20 г - Дистильована вода: 1000 мл. Стерилізують автоклавуванням при 115 С/10 хв.

Додаток 3: Приготування розкриваючих реагентів o Congo Red для середовищ YPMA та YPCA - 1% порошку Congo Red у 100 мл дистильованої води. o Люголь для середовища YPSA - Дистильована вода: 100 мл - Калій йодид: 2 г - Металоїд йод I 2: 1 го Люголь для середовища YPPA - 1 г діодину (I 2) - 5 г йодиду калію (KI) - Дистильована вода: 330 мл Додаток 4: Підрахунок клітин шляхом підрахунку на клітині Томаса Карре 3 Площа = 0,05 мм х 0,05 мм = 0,0025 мм2 Об’єм = 0,0025 мм2 х 0,1 мм = 2,5 х 10-4 мм3 = 2,5 х 10-7 мл [Концентрація клітин] = концентрація клітин] =. = 42,5 10 клітин/мл Для концентрації клітин 2,10 6 та за допомогою цифрового застосування нам буде потрібно: 59 мкл.