Гета-тестування на бета-таласемію (HBB) - Синево
Бета-таласемії представляють групу захворювань з аутосомно-рецесивною генетичною передачею, що характеризується низькою швидкістю синтезу β-ланцюгів глобіну.
Кластер генів β розміщений у хромосомі 11, розтягується на довжину 50 кб і містить у наступному порядку: ген епсилону (ε), 2 гени гамма (звані G γ та A γ), псевдоген β (ψβ), a ген дельта (δ) та β-ген (званий HBB), що кодує β -глобін 1. Кожен ген має 3 послідовності, що кодують білки (екзони), і 2 області, які, мабуть, не відіграють ролі в синтезі білка (інтрони = інтервенційні послідовності), оточені 5 'і 3' послідовностями, які також не втручаються в процес трансляції. На 5 'кінці кожного гена знаходиться промотор, послідовність, необхідна для ініціювання транскрипції. Промотор гена β включає 3 послідовності: коробку TATA, коробку CCATT та повторювані мотиви CACC. І екзони, і інтрони страждають від явища транскрипції ДНК в РНК-месенджер; цей процес контролюється факторами транскрипції, які зв'язуються з промоторами та елементами керування вище за течією - підсилювачами, які значно збільшують швидкість транскрипції. Таким чином, гени β-глобіну перебувають під впливом головного інтенсифікуючого елемента, який називається контрольною областю β-локусу (β-CSF) (див. Малюнок) 1; .
Феномен транскрипції включає такі етапи:
- фактична транскрипція: результатом є РНК-копія гена, що включає комплементарні послідовності як для екзонів, так і для інтронів;
- інкапсуляція та поліаденілювання (укупорка + поліаденілювання): прикріплення спеціальних нуклеотидів до 5 'і 3' кінців РНК;
- сплайсинг: видалення інтронів з мРНК; послідовності РНК, що відповідають екзонам, потім "іннуються" разом 3 .
Бета-таласемія частіше зустрічається у популяцій в середземноморському басейні, але це може постраждати від інших етнічних груп. Тяжкість дефекту мінлива. У звичайних людей є 2 алелі для β-глобіну, тому β-таласемія може виникати в гетерозиготному або гомозиготному стані. Оскільки існує велика кількість мутацій, пов’язаних з β-таласемією, можливі також випадки гетерозиготності сполук, які виникають, коли людина має 2 мутантних гени.
Описано дві широкі категорії β-таласемії:
-β або таласемія (бета нульова таласемія): характеризується відсутністю експресії аномального β-гена або, рідше, його делеції; коли дефект виявляється в гомозиготному стані (β o/β o), синтез β ланцюгів і неявно гемоглобін A повністю впливає;
-β + таласемія (бета плюс таласемія): характеризується зниженою (але не відсутньою) експресією аномального β-гена; при появі дефекту в гомозиготному стані відбувається певна продукція гемоглобіну A 1; 5 .
Складені гетерозиготи для β-таласемії можуть мати 2 різні гени β o або β + або обидва гени β + і β 0 (β +/β o).
Клінічна картина вкрай мінлива. Гетерозиготний статус для β-таласемії, також званий β-таласемією або β-таласемією незначною, в більшості випадків є клінічно безсимптомним станом. Гомозиготний статус або складова гетерозиготність для β-таласемії зазвичай призводить до важкого клінічного фенотипу, званого β-таласемією, при якому уражені особи залежать від переливання крові. Термін проміжна β-таласемія включає клінічні стани середнього ступеня тяжкості між незначними та основними формами; Постраждалі люди мають симптоматику і іноді можуть вимагати переливання крові, але це не є необхідним для підтримання життя 1 .
Генетичне тестування
В даний час відомо понад 200 мутацій, пов’язаних з β-таласемією, які можна виявити різними методами ПЛР, гібридизацією із синтетичними олігонуклеотидами або секвенуванням. .
У більшості випадків це мутації, які виникають в гені HBB або поблизу нього (заміни, делеції або вставки олігонуклеотидів з одним нуклеотидом). Залежно від генетичної події описано три типи мутацій:
-впливає на транскрипцію β-глобіну;
-що впливає на обробку мРНК (явища сплайсингу або поліаденілювання);
-які виробляють аномальний переклад мРНК (нісенітниця або мутація кадрів читання) 3 .
Низький відсоток випадків обумовлений великою делецією гена або контрольних послідовностей, розташованих вище за течією 1; 2 .
Що стосується тяжкості індукованого дефекту, мутації генів HBB діляться на дві широкі категорії:
Рекомендації щодо аналізу мутацій
-встановлення прогнозу з точки зору клінічного фенотипу (молекулярна диференціація основної проміжної таласемії);
-відстеження перевізників у сім'ях високого ризику;
-пренатальна діагностика бета-таласемії 5; 6 .
Зібраний зразок - кров прийде 4 .
Збиральний контейнер - пилосос, що містить ЕДТА як антикоагулянт 4 .
Кількість зібраного - стільки, скільки дозволяє вакуум 4
Причини відхилення спробувати - використання гепарину як антикоагулянта; коагульовані або гемолізовані зразки 4 .
Перевірка стійкості - 7 днів при 2-8ºC 4 .
Метод - комплектний секвенсор HBB 4 .
Інтерпретація результатів
Країна бета-таласемії (гетерозиготний статус)
Люди з β-таласемією, як правило, протікають безсимптомно; проте не виключено, що в умовах гемопоетичного стресу (вагітність, інтеркурентні інфекції) проявляються прояви анемії. У деяких пацієнтів може спостерігатися спленомегалія.
На гемограмі видно характерні зміни еритроцитарного ряду: незначне зниження значення гемоглобіну, збільшення кількості еритроцитів, низькі значення індексів еритроцитів VEM та HEM, ширина розподілу еритроцитів, як правило, нормальна. В середньому гематологічні змінні відрізняються в країнах β 0 та β +, хоча може бути значне перекриття. У випадках, коли α-таласемія співіснує, гематологічні відхилення менш помітні.
На мазку з периферичної крові, поряд з мікроцитозом, гіпохромією, пойкилоцитозом, "цільовими" еритроцитами, можуть спостерігатися базофільні пункції. Дослідження кісткового мозку свідчить про збільшення клітинності внаслідок гіперплазії еритроїдів.
Діагноз заснований на виявленні підвищеного відсотка HbA2 за допомогою електрофорезу гемоглобіну або хроматографічної техніки (ВЕРХ). Приблизно від третини до половини пацієнтів асоціюються із підвищеним відсотком рівня HbF.
Частка гемоглобіну А2 корелює з типом мутації бета-таласемії. Так, у більшості випадків гетерозиготності щодо β 0 або важкої β + -таласемії реєструється відсоток 4-5% HbA2, тоді як при легких формах β + -таласемії відсоток зазвичай становить 3,6-4,2%. Більш високі відсотки виявляються в країнах, пов'язаних з делецією 5 'частини гена HBB, а також у випадках мутацій промотору або ініціюючого кодону.
Причини β-таласемії з нормальним вмістом HbA2
Існують також форми β-таласемії з нормальним відсотком HbA2, які називаються тихою β-таласемією. Наприклад, у разі мутації C → G із положення 6, 3 'на кінцевому кодоні виявляється середній відсоток 2,4%.
Якщо у людини є показники еритроцитів, що свідчать про бета-таласемію, але рівень HbA2 не підвищений, важливо виключити δβ-таласемію, гемоглобінопатію Лепоре та α-таласемію. Може бути γδβ-таласемія, але такий стан є дуже рідкісним. У деяких пацієнтів із залізодефіцитною анемією можуть бути нетипові показники еритроцитів; особливо у дітей може бути залізодефіцитна анемія, що супроводжується збільшенням кількості еритроцитів.
Низький рівень феритину вказує на дефіцит заліза, але не виключає діагнозу бета-таласемії.
Мутації HBB, пов'язані з незначними або відсутніми гематологічними відхиленнями в гетерозиготному статусі, становлять важливі діагностичні проблеми; їх ідентифікація необхідна, оскільки вони можуть спричинити клінічно значущий стан у складних гомозигот або гетерозигот. Ці типи мутацій можна розділити на дві групи:
-мутації, що викликають "тиху таласемію" з показниками еритроцитів і нормальним відсотком HbA2;
-мутації, що викликають "майже тиху таласемію" з нормальним вмістом HbA2 та зміненими показниками еритроцитів.
Виявити ці форми можна лише за допомогою генетичного тестування. Деякі мутації, такі як +1480 C → G у грецької популяції, настільки м'які, що майже завжди викликають "тиху таласемію". Мутації, які найчастіше відповідають за цю форму таласемії, становлять -101 C → T та -92 C → T, пов'язані з такими середніми значеннями: VEM = 83,9 fL, HEM = 28,6 pg та HbA2 = 3,4%. "Майже тиха таласемія" виникає в результаті невеликої групи мутацій, таких як CAP + 1 A → C в Індії та інколи IVS-6 T → C в Середземномор'ї. Гетерозиготи для IVS-6 T → C показують такі діапазони значень: VEM = 60-78 fL та HbA2 = 3,2-4-6%.
Дефіцит заліза знижує відсоток HbA2 як у людей без дефектів глобіну, так і у людей з бета-таласемією. Це не є проблемою для людей з генетичними аномаліями, що супроводжуються значним збільшенням HbA2, але для тих, хто має незначні мутації, пов'язані з незначним збільшенням дефіциту заліза HbA2, маскує країну бета-таласемію. З цієї причини рекомендується спочатку коригувати дефіцит заліза у пацієнтів з важкою або середньою тяжкістю залізодефіцитної анемії, після чого, якщо зміни в показниках еритроцитів зберігаються, слід виміряти відсоток HbA2. Виняток з цієї рекомендації буде зроблено у вагітних пацієнтів, у яких діагноз бета-таласемії повинен бути поставлений негайно. У цій ситуації необхідно розслідувати партнера; якщо його виявлять у країні бета-таласемії, генетичне тестування буде розглянуто у вагітних із прикордонним рівнем HbA2.
Мегалобластна анемія також може призвести до зниження рівня HbA2 і перешкоджати діагностиці β-таласемії.
Пов’язаність змінених індексів еритроцитів з нормальним рівнем HbA2 також може бути результатом співіснування δ-таласемії з мутацією β 0 або β +, що індукує високий відсоток HbA2 (виявляється у ящірок та кипарисів). Кносський гемоглобін також відповідає за деякі випадки β-таласемії з нормальним рівнем HbA2.
Одночасна наявність м’якої мутації β-таласемії (наприклад, CAP + 1 A → C) та штаму α 0 -таласемії або гомозиготного статусу α + -таласемії часто змушує діагноз сили β-таласемії часто опускати.
Країна Β-таласемії з нормальними показниками еритроцитів та підвищеним вмістом HbA2
Деякі гетерозиготні пацієнти для деяких варіантів легкої β-таласемії можуть мати підвищений рівень HbA2 за наявності нормальних показників еритроцитів; такий стан було виявлено у деяких пацієнтів з мутацією -101 C → T.
Крім того, співіснування α та β-таласемії може призвести до нормальних показників еритроцитів завдяки більш збалансованому синтезу ланцюгів глобіну, але із збільшеним відсотком HbA2. Ця зміна особливо поширена у пацієнтів з делеціями двох α-генів або формою неаделеційної α-таласемії.
Набуті відхилення, такі як індуковані захворюваннями печінки, можуть збільшити значення індексу еритроцитів у пацієнтів з β-таласемією.
Усі ці приклади ілюструють складність випадків захворювання на β-таласемію та труднощі їх ідентифікації, оскільки генетичне тестування іноді є єдиним дослідженням, яке може підтвердити діагноз 1; 2 .
Хоча більшість людей, гетерозиготних за мутацією β-таласемії, мають клініко-патологічні особливості, що описуються як незначна таласемія (змінена гематологічна картина за відсутності клінічних проявів), у деяких з них розвивається спленомегалія, анемія, жовтяниця та жовчнокам’яна хвороба, стан, який називається β-таласемія. Фенотип подібний до β-таласемії проміжний і пов’язаний як з неефективним еритропоезом, так і з гемолітичним компонентом. Характерно наявність еритробластів з включеннями (що складаються з надлишкових α-ланцюгів та β-аномальних ланцюгів).
Описано понад 30 алелів, які індукують домінантний фенотип β-таласемії, включаючи мутації в 3 '-ій області екзонів 2 або 3, які спричиняють значну кількість мутантних мРНК. Як наслідок, синтезовані усічені або подовжені β-ланцюги, надзвичайно нестійкі, які співіснюються з нормальними α-ланцюгами 1 .
Це стосується клінічного фенотипу, спричиненого різними генетичними відхиленнями. Тяжкість проміжної β-таласемії варіюється від клінічного стану, що супроводжується затримкою росту та деформаціями кісток, при яких виживання рідко можливо без переливання крові, до більш легких форм, подібних до β-таласемії, але пов'язаних із більш високим ступенем. анемії та спленомегалії.
Можуть виникнути такі ускладнення, як: гіперспленізм, камені в жовчному міхурі, перевантаження залізом, явища компресії, що проявляються масами екстрамедулярної кровотворної тканини на життєво важливі органи.
Гематологічна картина включає аномалії, подібні до тих, що викликані типовою гетерозиготною β-таласемією, але має вищий ступінь тяжкості; поряд з мікроцитозом, гіпохромія, анізоцитоз, пойкилоцитоз, базофільні пункції, поліхроматофілія та циркулюючі еритробласти.
Електрофорез гемоглобіну або ВЕРХ свідчить про підвищений рівень HbA2 (вищий, ніж у країні β-таласемії) та HbF.
Проміжна β-таласемія може виникати у пацієнтів з одним або обома аномальними β-генами. Ті, які є гомозиготними або гетерозиготними сполуками для β-таласемічних алелів, мають мутації, пов’язані з легкими формами β + -таласемії, або мають покращуючі фактори, такі як співіснування сили α-таласемії або мутація, що призводить до посилення синтезу γ-ланцюга під гемопоетичного стресу. Ті, у кого є лише один аномальний β-ген, або мають домінантну форму β-таласемії, або асоціюються з мутаціями, що посилюють дисбаланс ланцюга глобіну, наприклад, гомозиготний або гетерозиготний статус для потрійного α або чотириразового α (α-гени, помножені на 3 або 4 разів).
Генетичне тестування сприяє виявленню відхилень, що визначають проміжний фенотип β-таласемії 1; 5 .
Складно гомозиготні або гетерозиготні пацієнти з мутаціями β-таласемії, які залежать від переливання крові, мають клінічний стан, який називається β-таласемією.
Захворювання часто розпізнається на першому році життя, починаючи з віку 3 місяців; вона характеризується важкою анемією, що супроводжується прискореним еритропоезом, як у медулярному, так і в екстрамедулярному секторах. Розширення кровотворення призводить до важких деформацій кісток, особливо кісток черепа та обличчя; екстрамедулярний кровотворення призводить до масивної гепатоспленомегалії.
Ряди еритроцитів мають такі значення: Hb = 3-7 г/дл, VEM = 50-60 фл, HEM = 12-18 пг. Мазок крові включає виражений мікроцитоз, гіпохромію, виражений анізоцитоз і пойкілоцитоз, базофільні проколи, циркулюючі еритробласти з гемоглобінізація та дизеритропоетичні особливості.
У випадках гомозиготної або складеної гетерозиготності щодо β 0 -таласемії (β 0/β 0) електрофорез гемоглобіну або методика ВЕРХ вказує на наявність лише HbA2 та HbF; коли пацієнти мають гомозиготність за β + -таласемією (β +/β +) або складну гетерозиготність за β 0 та β + -таласемію (β +/β 0), HbA також присутній до 35%.
При β-таласемії мажор відсоток HbA2 може бути нормальним, високим або, іноді, низьким 1; 2 .
1. Барбара Дж. Бейн. Діагностика гемоглобінопатії. Наука Блеквелл, 2001, 7-9; 73-93.
2. Катерина Боргна Піньятті, Ренцо Галанелло. Таласемії та супутні порушення синтезу гемоглобіну. У клінічній гематології Wintrobe, 11-е видання, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-1118.
3. Корнел Міронель Нікуле. Транскрипція (транскрипція). Біоінформатика. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/transcrierea.htm. Тип посилання: Інтернет-спілкування.
4. Синевська лабораторія. Конкретні посилання на використовувану технологію роботи 2010. Тип посилання: Каталог.
5. Ренцо Галанелло, Антоніо Као. Бета-таласемія. Огляди генів, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Інтернет-спілкування.
6. Talmaci R, Молекулярна діагностика -таласемій. Досягнення біотехнології, том II. Видавництво Ars Docendi, с.179-188, 2002.