Глікопротеїди людини з культур клітин тварин - спектр науки
Глікопротеїни людини з культур клітин тварин
Медична довідка
Будова ліганду Р-селектину відома. На «хребті» білка, амінокислотного ланцюга, п’ять молекул цукру (а саме фукоза, галактоза, N-ацетил-галактозамін, N-глюкозамін та нейрамінова кислота) розташовані в певній конфігурації на амінокислоті. Для того, щоб поліпшити шанси на успіх нашого проекту, ми дотримувались двох різних стратегій: у випадку шляху in vitro, поза живим організмом, структура цукру будується на пептиді спеціальними ферментами, глікозилтрансферазами. Більшість необхідних для цього ферментів комерційно не доступні. Вони повинні бути виготовлені біотехнологічно. З цією метою генетична інформація для людської глікозилтрансферази вводиться в клітину СНО. Ген глікозилтрансферази пов'язаний з сигнальною послідовністю, яка змушує клітину секретувати трансферазу. Потім ці клітини розмножуються і використовуються в культурах клітин для виробництва глікозилтрансфераз. На наступному етапі отримані таким чином ферменти використовуються для побудови цукрової структури ліганду Р-селектину. Нарешті, правильне розташування молекул цукру можна перевірити за допомогою мас-спектрометрії.
Шляхом in vivo, в межах живої клітини, генетична інформація для різних глікозилтрансфераз людини та генетична інформація про глікозильований білок вводяться в одну клітину СНО. На цей раз гени глікозилтрансфераз не забезпечені сигнальною послідовністю. Це локалізує трансферази в апараті Гольджі, органелі клітини (яка відповідає за конденсацію та покриття секрету). Гену білка передує сигнальна послідовність. Таким чином він "попередньо запрограмований" для розряду, і на виході з клітини проходить через апарат Гольджі. Тут вже чекають глікозилтрансферази, щоб перенести молекули цукру до білка. Перевага цієї стратегії полягає в тому, що клітина виділяє біологічно активний ліганд Р-селектину. Складність, однак, полягає в тому, щоб розташувати ці різні глікозилтрансферази в правильному співвідношенні між собою в апараті Гольджі.
Результати дослідження
За допомогою методу in vitro нам вдалося біотехнологічно одержати п’ять різних глікозилтрансфераз. За допомогою цих ферментів ми синтезували структуру цукру, яка дуже нагадує цільову структуру. Потрібно додати лише одну молекулу цукру - і необхідна для цього глікозилтрансфераза є у продажу. Клітинна лінія повинна продукуватися шляхом in vivo, який експресує людський ліганд Р-селектину у біологічно активній формі. Після двох років досліджень генної інженерії ми маємо кілька клітинних ліній, які відповідають цій вимозі. Виробництво цільового білка в біореакторах вже розпочато.
Завдяки чудовій співпраці між дослідницькими групами з п'яти європейських країн вдалося об'єднати біотехнологічні знання, розподілені по всій Європі, та досягти мети проекту. На додаток до Інституту біотехнологій при Форшунгсцентрум Юліх, Інститут фізіології Цюріхського університету, Школа стоматології Університету Копенгагена, Інститут технології ферментів Дюссельдорфського університету, Департамент біоорганічної хімії Утрехтського університету та Інститут глікобіології Університету Глікофіоду Університету Утрехта . Разом ми зробили перші успішні кроки, щоб зробити білок, що представляє великий терапевтичний інтерес, доступним. Наступні цифри показують, наскільки великий цей інтерес: З 350 генно-інженерних препаратів, які зараз проходять клінічне випробування в США, десять призначені для лікування септичних симптомів.