Хронічний протокол зразка зараженої сальмонелою миші (переклад на німецьку)

Резюме

Встановіть модель миші на хронічну бактеріальну інфекцію зі стійкою колонізацією Salmonella Typhimurium в кишечнику протягом 27 тижнів.

Анотація

Модель бактеріальної інфекції миші є потужною моделлю для досліджень в таких областях, як інфекція, запалення, імунологія, передача сигналу та пухлина. Багато дослідників скористалися колітом, індукованим сальмонелою тифімуріум, для вивчення ранніх стадій запалення та інфекції. Однак небагато повідомлень про хронічну інфекцію є in vivo. Миші, стійкі до існування сальмонели в шлунково-кишковому тракті, дозволяють дослідити тривалу взаємодію хазяїн-бактерія, передачу сигналу та пухлину. Ми встановили модель хронічної бактеріальної інфекції миші з колонізацією Salmonella Typhimurium в кишечнику миші протягом 6 місяців. Щоб користуватися цією системою, досліднику необхідно навчитися готувати бактеріальну культуру та давати тварин тваринам. Ми детально описуємо методологію підготовки бактеріальних культур та мишей для сортування. Ми також показуємо, як сальмонела виявляє стійкість у шлунково-кишковому тракті. Загалом, цей протокол допоможе дослідникам з бактеріальною інфекцією мишачої моделі принципово відповісти на біологічні та мікробіологічні питання.

Протокол

Цей протокол складається з трьох частин: посів бактерій, назогастральний зонд миші та виявлення сальмонели.

1. Умова росту сальмонели.

  1. Підготуйте тарілку з відваром сальмонели Лурія-Бертані (LB), інкубуйте при температурі 37 ° С протягом ночі.
  2. Виберіть клон з пластини LB і помістіть у 7 мл LB у пробірку об’ємом 12 мл і струшуйте при температурі 37 ° C приблизно 5 годин.
  3. Інокулюйте 50 мл LB 0,05 мл нерухомої фази культури і при 37 ° C без струшування протягом приблизно 18 годин.
  4. Закручують протягом ночі бактеріальну культуру при кімнатній температурі при 6000 об/хв протягом 10 хвилин для суспендування бактерій у HBSS у співвідношенні 100: 3 (LB: HBSS). Наприклад:
    Кожні 50 мл культури LB суспендують у 1,5 мл HBSS.
  5. Для пробірки для годівлі тварин додатково розбавляйте бактеріальний посів у співвідношенні 1:10. Наприклад:
    Кожна 1,5-мл культура LB суспендується у 15 мл HBSS.

2. Модель зараження сальмонелою *.

  1. Приготуйте розчин стрептоміцину. Кожній миші буде дано 7,5 мг стрептоміцину в 100 мкл HBSS. Наприклад, приготуйте загалом 90 мг стрептоміцину в 1,2 мл HBSS для 10 мишей. Завжди трохи більше обсягу, готуючи розчин стрептоміцину.
  2. Забирайте воду та їжу за 4 години до прийому всередину.
  3. Промийте мишей стрептоміцином 7,5 мг стрептоміцину (100 мкл HBSS для контрольних мишей). Великим і середнім пальцем міцно схопіть шкіру над плечем миші, вказівним пальцем випряміть голову та шию, щоб випрямити стравохід. Вирівняйте наконечник кульки голки на даху рота та на правій стороні задньої частини горла, потім обережно пропустіть його вниз у стравохід і введіть 100 мкл розчину. Жодного опору не повинно відчуватися.
  4. Через 20 годин після лікування стрептоміцином вода та їжа знову забираються до зараження мишей бактеріями.
  5. Кожному миші обробляють 100 мкл суспензії в HBSS або стерильним HBSS (контроль) перорально. Процедура сортування така ж, як і 2,3) мишам, що видаляють стрептоміцин.

* Дослідження на тваринах проводили з використанням специфічних безпатогенних самок мишей C57BL/6 (Taconic, Hudson, NY) віком 6-7 тижнів, як описано вище 1. Протокол був схвалений Комітетом університету Рочестера з питань тваринних ресурсів (UCAR).

3. Виявлення сальмонели в кишечнику.

  1. Зберіть кал за допомогою миші (приблизно 100 мг).
  2. Перенесіть зразок калу в 1,5-пробірку для мікроцентрифуги з 1 мл PBS і енергійно вихруйте.
  3. Центрифуга протягом 10 хв при 800 обертах на хвилину. Переносять супернатант у чисту пробірку для мікроцентрифуги.
  4. Центрифугування при 6000 об/хв протягом 5 хв. Супернатант викидають і 200 мкл PBS додають до гранул і перемішують на вортексі.
  5. Нанесіть 200 мкл PBS одноразовим шейкером на клітинку BBL CHROMagar для виявлення сальмонели. Сальмонели виглядають лілово-червоними (від рожевого до фіолетового, див. Малюнок 1). Якщо 200 мкл дає занадто багато колоній на пластині, використовуй 100 мкл або 50 мкл для смужки.

4. Репрезентативні результати.

Якщо протокол зроблено правильно, колонізація Salmonella typhimurium може виявлятися в кишечнику миші більше 6 місяців. Сальмонели можна було виявити через культуру калу протягом 6 місяців (рис. 1). Як типово для цієї моделі, втрата маси тіла та смерть настають протягом 4 тижнів після зараження. Залежно від штамів сальмонели, які використовуються для зараження, деякі миші не можуть вижити більше 6 місяців.

хронічний
ілюстрація 1. Кишкові сальмонели у видів сальмонел виглядають лілово-від рожевого до фіолетового кольору через метаболічні відмінності в присутності виділених хромогенів. Інші бактерії або гальмуються, або утворюють синьо-зелені або безбарвні колонії.

сальмонелою
Малюнок 2. Частка виживання мишей, інфікованих мутантною сальмонелою PhoP c, PhoP c Avra- та PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​протягом 4 тижнів (28 днів).

Таблиця 1. Вага тіла мишей, інфікованих сальмонелою протягом 4 тижнів.

0 1 тиждень 2 тижні 3 тижні 4 тижні
контроль 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP c 16,89 ± 1,03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20,05 ± 1,11
PhoP c Avra- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20,09 ± 1,17

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Для використання цієї системи дослідник повинен навчитися годувати тварин через носогастральний зонд. Ми детально описуємо методологію підготовки бактеріального посіву та видалення миші мишами. Ми також показуємо, як контролювати стійкість сальмонели до шлунково-кишкового тракту (ШКТ). Важливі кроки цього протоколу, включаючи:

  1. Попередня обробка стрептоміцину: попередня обробка стрептоміцину може позбутися частини коменсальної кишкової флори і зробити мишей сприйнятливими до зараження сальмонелою 2.
  2. Зонд для годування сальмонелою: для початківця зонд для годування може бути проблемою. У якийсь момент назогастральний зонд виходить з ладу, оскільки розчин випадково вводиться в дихальні шляхи і спричиняє загибель миші.
  3. Стійка колонізація бактерій: потрібен пильний нагляд за бактеріями в шлунково-кишковому тракті. На додаток до культури фекалій миші, вміст додатка також може бути використаний для виявлення сальмонели в пластинах BBL CHROMagar. Збирайте вміст додатків під час жертвоприношення мишей після зараження сальмонелою.

Ми тестували колонізацію сальмонели на мишах у різних концентраціях: 1 х 10 3 колонієутворюючих одиниць до 1 х 10 8 колонієутворюючих одиниць (100 мкл/миша). 1 х 10 жовтня 6-10 х 10 8 колонієутворюючих одиниць сальмонели змогли колонізувати мишей. Отже, виходячи з наших попередніх публікацій 1, 5 та неопублікованих даних, остаточна концентрація сальмонели в цьому розчині не буде вимірюватися до годування шлунковою зондом.

У цій експериментальній процедурі ми маємо специфічних безпатогенних самок мишей C57BL/6 (Taconic, Hudson, NY), яким було 6-7 тижнів. Використовувані штами бактерій включають штам Salmonella typhimurium дикого типу ATCC14028s (WT-SL), непатогенний мутант сальмонели PhoP c3, PhoP c Avra ​​та PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​(таблиця 2). За цим протоколом колонізація Salmonella typhimurium в кишечнику миші може бути виявлена ​​більше 6 місяців (рис. 1). Інфекція сальмонели та запалення, виміряні спостереженням калу та ваги хлопців. Коли відбирали зразки тканин і крові, довжину кишечника вимірювали як особливість запалення кишечника. Також обстежували ваги селезінки та печінки. Миші-сироваткові цитокіни тестували методом ELISA5. Крім того, біохімічні та молекулярні методи надалі використовуються для перевірки змін запальних цитокінів та патологічних змін, викликаних сальмонелою 5.

Як правило, втрата ваги та смерть настають протягом 4 тижнів після зараження (табл. 1). Після зараження сальмонелою спостерігалася значна втрата маси тіла у групах бактеріальних інфекцій порівняно з контрольною групою без бактеріального лікування (* заражені ПК, 78% PhoP c Avra- або 70% PhoP c AvrA-/AvrA + можуть зберігатися при Після гострої інфекції всі, хто вижив, все ще перенесли сальмонелу, яку можна було виявити після зараження через 6 місяців після процедури, описаної в цій пропозиції. Після того, як миші вижили через 3 тижні після зараження, миші набрали вагу тіла і менше випадків смертей Крім того, дані імунофлюоресцентного фарбування також показують вторгнення сальмонели в слизову оболонку кишечника через 27 тижнів після зараження (рис. 3). Ці дані показали, що PhoP c, PhoP c Avra ​​або PhoP c AvrA/AvrA + може використовуватися для моделі хронічної інфекції.

Миші з фактором стійкості хазяїна Nramp1 +/+ стійкі до сальмонельної інфекції 3-6. Миші C57/BL6 з NRAMP були дефектними в поточних дослідженнях. Ми виявили, що 90% мишей, заражених патогенним штамом сальмонели 14028, не можуть вижити більше 4 тижнів (дані не наведені). Щоб зрозуміти довгострокові наслідки дикого типу S. Інфікування тифімурієм, мишей з Nampr1 +/+ можна використовувати.

Ця модель створена в лабораторії BSL-2. Наш протокол затверджений Комітетом університету Рочестера з питань тваринних ресурсів (UCAR). Миші, інфіковані сальмонелою, можуть відчувати дискомфорт і стрес, ставати менш активними та повільними. Їх шерсть може бути щетиною, і їм заборонено годувати та пити, як зазвичай. За тваринами будуть уважно спостерігати, і якщо з’являться будь-які ознаки дискомфорту, такі як недостатня амбулація для збереження гідратації та споживання калорій, якщо миша показала ознаки аспірації рідини або значної втрати ваги (10% і більше) померти, миша була гуманно евтаназована. Весь персонал лабораторії буде навчений спостерігати за мишами згідно з 8, 9.

Багато досліджень попередньої обробки стрептоміцину використовували коліт, індукований Salmonella typhimurium, для досліджень ранньої фази інфекції 1,2,10. Однак лише деякі повідомили про хронічну інфекцію на мишачій моделі in vivo 11. Миші з сальмонелою, що постійно існують в шлунково-кишковому тракті, дозволяють дослідити тривалу взаємодію хазяїн-бактерія, передачу сигналу та пухлину. Ми встановили модель хронічної бактеріальної інфекції миші із заселенням Salmonella typhimurium у кишечнику миші протягом 6 місяців. Ця модель також може бути використана для вивчення патогенезу E.coli та пробіотиків. Загалом, цей протокол допоможе дослідникам із принципово важливою моделлю миші відповісти на біологічні та мікробіологічні питання.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.