Кишкова паличка як пробіотичний препарат молекулярних та функціональних препаратів
Кишкова паличка як активний пробіотичний інгредієнт у фармацевтичних препаратах Молекулярно-функціональна характеристика штамів, що сприяють здоров’ю, ДИСЕРТАЦІЯ для здобуття вченого ступеня Доктор rerum naturalium (доктор рен. Наук.) Факультету математики та природничих наук Технічного університету Дрездена, представлений дип. Біол. .1980 у Дрездені, поданий 27 квітня 2012 року
Зміст ЗМІСТ ЗМІСТ. СПИСОК СКОРОЧЕНЬ. E СПИСОК ФІГУР. H ПОКАЗНИК ТАБЛИЦ. J 1 ВСТУП. 1 1.1 Мікрофлора кишечника людини. 1 1.1.1 Склад і функції кишкової флори. 1 1.1.2 Роль кишкової палички. 3 1.2 Порушення флори кишечника та захворювання. 4 1.3 Пробіотики. 6 1.3.1 Визначення, вимоги, приклади. 6 1.3.2 Ефекти та механізми. 7 1.3.3 Сфери застосування. 9 1.3.4 Mutaflor та Escherichia coli Nissle 1917. 10 1.3.5 Пробіотики від SymbioPharm. 10 1.3.5.1 Продукція від SymbioPharm. 10 1.3.5.2 Симбіофлор 2 - склад та активні принципи. 11 1.4 Секвенування геному E. coli. 12 1.5 Протимікробні пептиди з прокаріотів. 13 1.5.1 Визначення та класифікація бактеріоцинів. 13 1.5.2 Мікрозин. 15 1.5.3 Сфери застосування - сьогодення та майбутнє. 18 1.6 Завдання та завдання. 20 2 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ. 21 2.1 Матеріали. 21 2.1.1 Використані хімічні речовини та витратні матеріали. 21 2.1.2 Використані набори. 21 2.1.3 Буфери та складські розчини. 2.1.4 Поживні середовища для вирощування бактерій. 22 2.1.5 Антибіотики. 23 2.1.6 Аксесуари для культури клітин. 23 А
Зміст 2.1.7 Штами бактерій. 24 2.1.8 Плазміди. 25 2.1.9 Олігонуклеотиди. 26 2.1.10 Ферменти. 27 2.1.11 Програмне забезпечення. 27 2.2 Методи. 28 2.2.1 Культивування прокаріотичних клітин. 28 2.2.1.1 Вирощування бактерій. 28 2.2.1.2 Тваринництво. 28 2.2.1.3 Криві зростання. 28 2.2.2 Культивування еукаріотичних клітин. 29 2.2.2.1 Культура клітин. 29 2.2.2.2 Заморожування та розморожування. 29 2.2.3 Досліди спільної культури з клітинами прокаріотів та еукаріотів. 29 2.2.3.1 Аналіз дотримання. 29 2.2.3.2 Аналіз вторгнення. 31 2.2.3.3 Конфокальна мікроскопія. 32 2.2.3.4 Електронна мікроскопія. 32 2.2.3.5 Випробування зони гальмування. 33 2.2.4 Молекулярно-біологічні методи. 33 2.2.4.1 Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР). 33 2.2.4.2 Послідовність коротких зрізів ДНК. 35 2.2.4.3 Електрофорез в агарозному гелі. 36 2.2.4.4 Очищення ДНК. 36 2.2.4.4.1 Очищення фрагментів ДНК. 36 2.2.4.4.2 Очищення за допомогою гелевої екстракції. 37 2.2.4.4.3 Очищення реакцій секвенування. 37 2.2.4.4.4 Спиртові опади. 37 2.2.4.5 Визначення концентрації ДНК. 38 2.2.4.5.1 Вимірювання поглинання. 38 2.2.4.5.2 Визначення концентрації в агарозному гелі. 38 2.2.4.6 Застосування ендонуклеаз рестрикції. 38 2.2.4.7 Дефосфорилювання. 39 2.2.4.8 Перев'язка. 39 2.2.4.9 Виробництво компетентних осередків. 39 2.2.4.10 Електропорація. 40 2.2.4.11 Відмінювання. 40 Б
Зміст 3.2.3.3 Escherichia coli G3/10 - Виявлення антимікробного пептиду. 86 3.2.4 Виявлення мікрозину S у кишкової палички G3/10. 89 3.2.4.1 Аналіз кодування оперону для Мікрозіна С. 89 3.2.4.2 Імунітет до мікрозину P. 90 3.2.4.3 Скринінг на наявність гена mcss, що кодує мікрозин S у Enterobacteriaceae. 92 3.2.4.4 Виявлення бактерицидного ефекту мікрозину с. 92 3.2.4.5 Тест зони інгібування. 94 3.2.4.6 Коінфекційні експерименти з ентерогеморагічною кишковою паличкою. 95 3.2.4.7 Аналіз структури білка та класифікація. 99 4 ДИСКУСІЯ. 103 4.1 Симбіофлор 2 кишкова паличка - аналіз геному та пробіотики. 103 4.1.1 Геноми симбіофлору 2 кишкової палички. 104 4.1.2 Пробіотичний ефект Symbioflor 2. 105 4.1.3 Безпека Symbioflor 2. 106 4.1.4 Порівняння Escherichia coli G3/10 з Escherichia coli Nissle 1917. 109 4.2 Антимікробні пептиди у Enterobacteriaceae. 111 4.3 Можливе використання мікрозину с. 113 4.3.1 Харчова промисловість. 113 4.3.2 Мікрозін S - новий антибіотик. 115 4.3.3 EHEC - приклад застосування. 116 5 РЕЗЮМЕ/РЕЗЮМЕ. 119 5.1 Короткий зміст. 119 5.2 Короткий зміст. 120 6 ЛІТЕРАТУРА. 123 7 ДОДАТОК. 140 ПУБЛІКАЦІЇ. 172 ПОДЯКИ. 174 р
Список скорочень SAP SD SDS Singleton-Gen Sm sp. ssp. ST STEC stx SUE T a TBE TE Tet TNF trna U UE UPEC UV V VTEC ZKBS ZO Креветка лужна фосфатаза стандартне відхилення Ген додецилсульфат натрію, який є специфічним для геному Стрептоміцин Підвид Теплостійкий токсин Шига токсин продукує токсин Е. coli Шига токсин Серйозні небажані Температура накопичення подій Трис-борат-ЕДТА Трис-ЕДТА Тетрациклін Передача фактору некрозу пухлини Одиниці рибонуклеїнової кислоти Небажана подія Уропатогенний E. coli Ультрафіолетовий вольт Продукція веротоксину E. coli Центральна комісія з біобезпеки Zonula occludens G
Перелік рисунків Рисунок 3.31: Скринінг мікрозину H47 гена mchb у різних штамів EHEC. 99 Рисунок 3.32: Амінокислотна послідовність білка-попередника Mikrozin S. 99 Рисунок 3.33: Порівняння амінокислотних послідовностей білків-попередників мікрозинів класу IIa. 101 Рисунок 4.1: Порівняння послідовностей у промоторній області оперону глікабд E. coli G1/2 та E. coli CFT073. 108 Рисунок 4.2: Структурні компоненти EcN (A) та E. coli G3/10 (B). 110 Рисунок 7.1: Аналіз BLASTp білків McsA (A) та McsB (B). 164 І.
Вступ 1.5.2 Мікрозин Термін мікрозин був введений в 1976 році (Asensio та Perez-Diaz, 1976) для позначення рибосомно синтезованих антимікробних пептидів з низькою молекулярною масою 5 кда. Каркас пептиду не зазнає жодних модифікацій. Лінійні поліпептиди мають С-кінцевий сидерофор як посттрансляційну модифікацію (Vassiliadis et al., 2007). Мікрозини класу IIa, як правило, організовані в чотири гени, кодовані на великих плазмідах з невеликим числом копій. До них належать мікрозини V (MccV, раніше ColV), L (MccL) і 24 (Mcc24). Білок імунітету кодується в безпосередній близькості від мікроцину. Крім того, утворюються два білки, що беруть участь в експорті. Транспортні білки класу мікроцинку дуже гомологічні. Самі мікрозини мають характерні сигнальні пептиди. MccV і MccL утворюють дисульфідні мости. На відміну від усіх згаданих дотепер мікрозинів, мікрозини класу IIb мають хромосомне кодування. Генетична організація дуже складна. Прикладом є пробіотичний штам E. coli Nissle 1917, який утворює мікрозини M (MccM) та H47 (MccH47) (Patzer et al., 2003). Кодуюча область мікрозину містить гени 17
Матеріали та методи psym5 psym6 psym7 psym8 psym9 psym10 psym11 psym12 psym1-st76an Amp R, система спряження pilx, mcss, mcsi, mcsa, mcsb ця робота ця робота ця робота ця робота ця робота ця робота ця робота ця робота ця робота paz6 Amp R, mcss, mcsi, mcsa, mcsb ця робота paz8 amp R, mcsi, mcsa, mcsb ця робота paz9 см R, mcss ця робота paz10 см R, ORF1 ця робота paz11 см R, ORF2 ця робота paz12 см R, скорочено mcss ця робота paz13 Amp R, mcsi ця робота paz14 Amp R, скорочено mcsi ця робота paz15 Amp R, PBAD, mcss ця робота pgs1 Amp R, PBAD ця робота MCS = сайт множинного клонування; ori TS = чутливий до температури початок реплікації; I-SceI = мегануклеаза; FRT = ціль розпізнавання фліппази; FLP = фліппаза; ORF = відкрита рамка читання; PBAD = промотор активатора араку; Amp = ампіцилін; См = левоміцетин; Кана = канаміцин; Тет = тетрациклін. 2.1.9 Олігонуклеотиди Список олігонуклеотидів, що використовуються Biomers (Ulm), наведено в Додатку в Таблиці 7.1 та Таблиці 7.2. 26-й
Результати 3 РЕЗУЛЬТАТИ 3.1 Аналіз геномів бактерій 3.1.1 Геном Escherichia coli G3/10 Послідовність проводили, як описано в розділі 2.2.5.1. Геном кишкової палички G3/10 складається з 4935403 основ. Вміст ГХ становить 50,88%. Автоматична та ручна анотація ідентифікувала 4844 гени, 87 транскриптів trna та 22 транскриптів rrna. Геном у круговій формі показаний на малюнку 3.1. Під час анотації кожній послідовності кодування (CDS) було присвоєно ім'я, так званий локусний тег, назву гена та генний продукт із коротким описом. Основою для цього послужили аналіз та порівняння BLASTn та BLASTp із записами у відповідних базах даних (Altschul et al., 1990) (джерела: [5,6]). Кадри зчитування анотувались автоматично і при необхідності коригувались вручну (див. 2.2.5.3). Початок геному E. coli G3/10 визначався геном dnaa. В даний час геном складається з чотирьох великих ділянок з трьома прогалинами невизначеної послідовності, які неможливо закрити за допомогою ПЛР. Повна послідовність геномів буде вільно доступна в базі даних після публікації (Zschüttig et al., Рукопис у підготовці). 51
Результати Рисунок 3.1: Кругове представлення геному E. coli G3/10. Зовнішнє кільце містить масштаб у кілобазах (kbp). У другому кільці гени прямого ланцюга показані синім кольором. Кільце 3 чорним кольором показує гени ядерного геному, яке воно містить. Кільце 4 і кільце 5 відповідно показують гени комплементарної ланцюга синім кольором, а гени ядерного геному - чорним. Два внутрішні кільця показують вміст GC (кільце 6) і перекіс GC (кільце 7), за допомогою яких можна визначити походження реплікації oric і кінцевий терк. Передня і комплементарна нитки містять приблизно однакову кількість генів (кільце 2 і 5). Гени ядерного геному (кільця 3 і 4) розподілені по обох ланцюгах. Деякі більші ділянки, які не містять жодних генів основного генома, відповідають геномним островам і профаговим областям, у яких вміст ГХ суттєво відрізняється від середнього вмісту ГХ у геномі (кільце 6). Вони часто асоціюються з трна. CDS = послідовності кодування. 52
Результати E Малюнок 3.2AE: Кругове представлення геномів E. coli G1/2 (A), E. coli G4/9 (B), E. coli G5 (C), E. coli G6/7 (D) та E. coli G8 (E). Зовнішнє кільце містить масштаб у кілобазах (kbp). У другому кільці гени прямого ланцюга показані синім кольором. Кільце 3 чорним кольором показує гени ядерного геному, яке воно містить. Кільце 4 і кільце 5 відповідно показують гени комплементарної ланцюга синім кольором, а гени ядерного геному - чорним. Два внутрішні кільця показують вміст GC (кільце 6) і перекіс GC (кільце 7), за допомогою яких можна визначити походження реплікації oric і кінцевий терк. Передня і комплементарна нитки містять приблизно однакову кількість генів (кільце 2 і 5). Гени ядерного геному (кільця 3 і 4) розподілені по обох ланцюгах. Деякі більші ділянки, які не містять жодних генів основного генома, відповідають геномним островам і профаговим областям, у яких вміст ГХ суттєво відрізняється від середнього вмісту ГХ у геномі (кільце 6). Вони часто асоціюються з трна. CDS = послідовності кодування. 56
Результати Геномотипи кишкової палички, локалізовані з Symbioflor 2. EcN вважається особливо пристосованим через кількість систем поглинання заліза, що перевищує середнє (Grozdanov et al., 2004). Генотипи кишкової палички з Symbioflor 2 несуть деякі системи поглинання заліза, що створює конкурентні переваги. Однак у цих кишкових паличках немає більше систем поглинання заліза, ніж у інших порівнянних штамів E. coli. 3.1.4 Плазміди E. coli Symbioflor 2 - це дикі типи, які несуть кілька природних плазмід. Огляд усіх плазмід, що містяться, показаний на малюнку 3.6 за допомогою агарозного гелевого зображення. 62 Рисунок 3.6: Плазміди у диких типах симбіофлору 2 E. coli. Нумерація відповідає назві плазміди, напр. 3 для плазміди psym3. * psym1 працює на рівні геномної ДНК. psym5 і psym6 ледь помітні на гелевому зображенні і, ймовірно, присутні в дуже малій кількості копій. М = стандарт розміру.
Результати Кільцева структура була закрита вручну. Швидше за все, їх буде дуже мало. Рисунок 3.7: Мегаплазмід psym1 з E. coli G3/10. Довжиною понад 40 кб плазміда на 99% ідентична pmas2027 з уропатогенної кишкової палички MS2027 (Ong et al., 2009). На додаток, однак, вставляється область розміром 10 кб (позначена синім кольором), в якій кодується нещодавно ідентифікований у цій роботі мікрозин S (див. 3.2.4). Два зовнішні кільця містять кодуючі послідовності (CDS) прямої та зворотної ланцюга. Вміст GC відображається чорним кольором у третьому кільці. Кільце 4 показує GC-Skew зеленим (+) та фіолетовим (-). 64
Результати ori endo 4000 1800 200 rom/rop 3000 psym2 4197 bps 1000 1400 1600 psym3 1934 bps 400 600 1200 800 2000 1000 csm repa 1200 6000 200 1000 1000 psym4 1304 bps 400 repa 5000 psym5 6567 bps 2000 800 4000 600 3000 ori mobc 10000 4000 8000 psym6 10433 bps 2000 psym7 4452 bps 1000 3000 6000 4000 2000 moba tnpa mobb tnpr mobd Рисунок 3.8: Плазмідні карти плазмід, що містяться в Symbioflor 2 E. coli, з анотацією кодуючих послідовностей. 65
Результати ORF-3 12000 2000 2000 ORF-1 ORF-1 1500 psym8 2353 bps 500 ORF-2 ORF-4 ORF-5 10000 8000 psym9 12686 bps 4000 1000 6000 ORF-8 ORF-2 ORF-7 ORF-6 1400 ori 3000 repa 200 500 1200 psym10 1549 bps 400 2500 psym11 3215 bps 1000 1000 600 2000 800 1500 orit ori mobd/mbkd mobb/mbkb 7000 6000 1000 moba/mbka 5000 psym12 7111 bps 2000 csa mobc/mbkc 4000 3000 oriv csl csi Рисунок 3.8: Плазмідні картки плазмід, що містяться в Symbioflor 2 E. coli, з анотацією кодуючих послідовностей. (Продовження). 66
Рисунок 3.9: Контроль специфічності розроблених штамових та групово-специфічних ПЛР для E. coli G1/2, G6/7 та G8 (A), E. coli G3/10 (B), E. coli G4/9 (C) та Кишкова паличка G5 (D). Отримані смуги обрамлені червоним кольором. Цифри (#) стосуються головної колекції робочої групи Gunzer. M = стандарт розміру, NK = негативний контроль.
Таблиця результатів 3.5 Огляд геномів симбіофлору 2 кишкової палички (станом на січень 2012 р.). Генотип E. coli G1/2 E. coli G3/10 E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G6/7 E. coli G8 Кількість плазмід Приблизна довжина хромосоми [bp] 1 Приблизна довжина генома [bp] 1,2 Номер контигу 1 Розрахункова кількість генів 2 Кількість трна 2 4748500 4757166 36 4478 82 22 6 4935403 5010410 484844 87 22 1 4514694 4515998 29 4163 72 22 5 4578897 463357 43 4296 84 22 2 4 978 623 4 987 283 41 4729 81 22 2 4873 886 4882 546 62 4636 73 22 номер rrna 1 Значення відповідають контигам, призначеним на дату. 2 Геном складається з хромосоми плюс плазмід. E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G3/10 E. coli G6/7 E. coli G8 E. coli G1/2 Рисунок 3.10: Порівняння геному симбіофлору 2 E. coli (станом на січень 2012 р.). Філогенетичне дерево було сформовано за допомогою EDGAR (Blom et al., 2009) та на основі основних геномів. 70
Результати Рисунок 3.31: Скринінг гена mchb мікрозину H47 у різних штамів EHEC. Різні штами EHEC, EcN та E. coli G3/10 тестували, використовуючи праймери mchb_bamhi та mchb_sphi. Ген мікрозину H47 був виявлений у штамах EHEC DD, FO1 та FO2. ПК = позитивний контроль, NK = негативний контроль. 3.2.4.7 Аналіз структури і класифікації білка Мікрозин S (MccS), виявлений у E. coli G3/10, є білком 120 АА з розрахунковою молекулярною масою 11,67 кда. Термін мікрозин був введений для позначення невеликих антибактеріальних пептидів з молекулярною масою