Первинна трансплантація зародкових клітин для стрибкоутворення на основі CRISPRCas9 у протоколі Xenopus

Резюме

Гени, необхідні для виживання, створюють технічні бар'єри для створення ліній мутантів. Скакун обходить летальність, поєднуючи редагування геному з первинною трансплантацією зародкових клітин, щоб створити диких тварин, що несуть мутації зародкової лінії. Спалювання етапів також дозволяє ефективно генерувати гомозиготних нульових мутантів у поколінні 1F.Тут демонструється етап трансплантації.

Анотація

Вступ

Очікується, що Бонд прискорить генетичні підходи в Xenopus. "Кроки опіку" також надає альтернативу методу "передачі господаря" 22 для LOF-аналізу генів материнського ефекту (неопубліковано). У цій публікації докладний опис методу, зосереджений на трансплантації PGC, представлений у X. tropicalis (з незначними модифікаціями для X. laevis). Тут демонструється трансплантація PGC, щоб сприяти більш швидкому передаванню цієї технології іншим лабораторіям, які працюють з Xenopus. Принципи цього методу повинні бути успішними в інших земноводних (наприклад, уроделесах), а специфічні для організму модифікації методології повинні дозволяти застосовувати до багатьох інших тварин, у яких може бути здійснений ефективний мутагенез і PGC легко пересаджується.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі методи, описані тут, схвалені Комітетом з планування Каліфорнійського університету, Ірвін та Інституційним доглядом за тваринами.

1. препарати, призначені для трансплантації PGC

250 мкг sgРНК; Подивіться Обговорення) 24. Через 10-20 хв загоєння місця ін’єкції перенесіть ембріони в покритий агарозою посуд, що містить 1/9 х MMR, та інкубуйте при 25 ° C. Також створіть посуд із недвійних ембріонів, який буде служити реципієнтом трансплантації. Приготуйте чашки Петрі (60 мм), які містять a

Шар 1 мм агарози товщиною 5 мм в 0,3 х MMR, якщо трансплантують органи X. tropicalis, або 1 x MMR X. laevis.

    Створюйте депресії

Глибиною 3-4 мм, вставляючи форму з 3-х 4-лунковими прес-формами (створену розрізанням 96-лункової ПЛР-пластини) в розплавлену агарозу під час заливки пластин (див. Рисунок 1 і D). Тримайте форму на кілька міліметрів над дном чашки Петрі за допомогою пари плоскогубців, прикріплених до кільцевого тримача, поки агароза не затвердіє.

  • Крім того, зробіть 24-лункову ембріональну платівку для однієї сім’ї, покривши лунки тонким шаром 1% агарози в 1/9 х MMR.
    Примітка: Живильне середовище, додане в ці лунки, становить 1/9 х MMR з додаванням 50 мкг гентаміцину сульфату/мл.

    • 2. трансплантація PGC

      Коли ембріони досягають лише стадії бластули Nieuwkoop і Faber 28 (Рисунок 2a),

    3. після загоєння, догляд за ембріоном

    ПРИМІТКА: Трансплантати заживають на місці всередині

    30 хв, і це нормально спостерігати деякі залишки лізису клітин жовтка, що виділяються з ембріона (Рисунок 3).

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Після трансплантації слід якісно визначити ефективність мутагенезу CRISPR/Cas9, перш ніж докладати зусиль у розведенні, щоб розвивати та підтримувати тварин до статевої зрілості. Оскільки тварини, які переносять високоросту жабу, соматично дикого типу, а до зародкової лінії важко отримати доступ для прямих вимірювань, стає важливим зберегти трупи донорських ембріонів. Аналіз ДНК туші діє як проксі для вимірювання мутагенезу, який відбувається у реципієнтів трансплантації статевих клітин 17 .

    Подібні результати були отримані від 17 F0, що перетинають тварин, що несуть мутації в гомеотичному ящику (що кодує ДНК-зв'язуючий гомедомен) гена гуськоїда (CGC) (див. Малюнок 4 a, C-H). Відсутність експресії CGC з використанням антисмислових морфоліно-олігонуклеотидів у X. laevis передбачає, що ген CGC необхідний для повноцінного розвитку передньої головки 32, а пуголовки, що вводяться Cas9-sgRNA, також демонструють ембріональні летальні фенотипи 17. Однак стрибані тварини 0 F, які є соматично дикими типами, є життєздатними та надійними, а 1 F інтеркрос продукує ембріони з фенотипами LOF, ідентичні тим, що опубліковані в X. laevis fold pass 17. Ці дані забезпечують генетичне підтвердження фенотипу морфоліно, а також доказ принципу того, що пропуск стадій долає ембріональні летальні фенотипи.

    клітин
    Рисунок 1: Матеріали, необхідні для трансплантації. Боросилікатне скло (AT) Піпетки Пастера використовуються для виготовлення ножів для волосся для брів та петель для волосся для мікрохірургічного втручання на ембріонах на ранніх стадіях. Малювання на склі за допомогою пальника Бунзена забезпечує більш вузький кінець для введення волосся. Червона стрілка вказує приблизне положення, при якому скло має розбитися. () приклад ножа для волосся для брів (вгорі) та локона для волосся (внизу), пропіпетований швидкосохливим клеєм. (VS), частина 96-лункової ПЛР-платівки використовується для створення западин в агарозному гелевому планшеті, дозволяючи 1% -ній агарозі застигнути навколо форми (агароза, виготовлена ​​при 0,3 х 1 х MMR, згідно з тим, що трансплантація органів виконується в X. tropicalis або X. laevis, відповідно). Товщина агарози становить

    5 мм, із свердловинами глибиною 3-4 мм. (D) приклад трансплантованої агарозної гелевої пластини з 12 западинами, як показано в таблиці VS. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок 2: Морфологія полюса рослини під час пізньої бластули до ранніх стадій гаструли та стратегія дисекції. (A-F) Зародки Xenopus tropicalis відображаються на рослині з середнім інтервалом часу протягом півгодини, від початку стадії бластули 9 (4,5 к.с.) до ранньої стадії гаструли

    10,25 (7 к. С.) До 5 к.с. бластомери великі і їх легше пошкодити. Біле, пунктирне коло позначає очікуване положення формування клітин пляшки під час гаструляції, що можна побачити, формуючи старт на спинній стороні (зверху) у наборах (Е і F). Щоб пропустити кроки, чотири розрізи виконуються в квадраті, представленому чорними пунктирними лініями, з остаточним зрізом, зробленим паралельно поверхні тканини (не показано), щоб звільнити рослинний імплантат. Шкала = 400 мкм. натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок 3: Трансплантація. (AT) приклад ембріона hpf

    5.5 після видалення рослинної тканини, що містить PGC. Чорно-біле пунктирне коло з пунктирною областю мають такі самі відносні розміри, як показано на малюнку 2. () рослина експлантата, взята з ембріона в стінці A, внутрішня поверхня якої спрямована на глядача, становить приблизно 0,4-0,45 мм на сторону і 0,25-0,3 мм в глибину. (VS) ембріон із пересадженою рослинною тканиною. Зображення отримано

    Через 10 хв після трансплантації. Тканина (D) Через 30 хв після пересадки рослина, як видно, зажило на місці (обережно закручуючись ножем від волосся брів над тим, що ембріон був використаний для створення вихору, який змітав сміття в скупченні VS). Після переведення в 1/9 x MMR та інкубації при 25 ° C більшість ембріонів гаструлюють нормально. Шкала = 400 мкм. натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Хрест Самець Самка Альбінос Дикий тип Разом Альбіноси%
    1 LF1 Tyr- /- 160 0 160 100
    2 LF2 Tyr- /- 148 0 148 100
    3 Tyr- /- OFP 409 0 409 100
    4 Tyr- /- LF4 0 519 519 0
    5 Tyr- /- LF5 223 0 223 100
    6 LF6 Tyr- /- 493 703 1196 41.2
    7 Tyr- /- LF7 1 94 95 1.1
    8 Tyr- /- LF8 125 0 125 100
    9 Tyr- /- LF9 0 417 417 0
    10 Tyr- /- LF10 252 0 252 100

    Таблиця 1: Ефективне заміщення зародкової лінії трансплантатами стрибкової жаби, що несуть мутації тирозинази. Орієнтуючись на тирозиназу, отримували трансплантацію тваринам обох статей. Цих тварин схрещували з альбіносами, які є тиро-/- гомозиготними, щоб перевірити ефективність передачі зародкових ліній мутантних алелів та відсоток ембріонів F1, які виявляли альбінізм, вимірювали на стадії пуголовків. Записи у стовпцях "Самець" та "Самка" вказують, хто з батьків є тир-/- або похідною твариною, яку потрібно сформувати (ЛФ). Відсоток ембріонів у схрещуванні, що демонструє фенотип альбіноса, вказаний під "% альбіноса". Зверніть увагу, що 6 з 10 тварин з трансплантацією високорослих жаб показали повну (100%) заміну мутантними алелями. Ця таблиця взята з Blitz et al. 17, з дозволу.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Цей звіт містить детальний протокол трансплантації рослинної тканини, що містить PGC. Трансплантація PGC використовується разом із технологіями редагування геному (наприклад, CRISPR/Cas9) для модифікації статевих клітин тварини, зберігаючи майже всю її соматичну тканину як генетично дикий тип. Щоб вирізати кути для досягнення успіху, перед пересадкою органів слід врахувати низку важливих факторів.

    Для того, щоб забезпечити повну заміну зародкової лінії мутантними алелями, рекомендується спочатку визначити ефективність sgРНК in vivo. Досвід показує, що більшість sgРНК, розроблені CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) або CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/), ефективні при використанні при 250 пг/ембріон. Однак у деяких випадках може знадобитися використання більш високих концентрацій (наприклад, CGC sgRNA, опублікована Blitz et al. 17, необхідна 1

    нг/ембріон). Важливо оцінити ефективність мутагенезу на цільовій ділянці, а використання припливу дозволяє кількісно оцінити 31. Хоча описаний тут метод використовує пряме секвенування Пенсер ПЛР-ампліконів (що представляє популяцію мутантних алелів в 0 F ембріонах), багато інших методів було використано в літературі з редагування геномів для цієї мети. Інші загальновживані техніки з низькою та середньою вартістю включають аналіз RFLP з використанням або рестрикційної втрати ферментів 33, або сайтів розщеплення Cas9/TALEN 34, ендонуклеази T7 1 35 та аналізів геодезистів 36, аналізу мобільності гетеродуплекса 37. аналіз розплавлення з роздільною здатністю 38, аналіз фрагментів капілярним електрофорезом 39, 40 та методами 41, 42 на основі qPCR .

    Другим фактором є вибір місця розташування цільової ділянки гена-мішені. Для того, щоб забезпечити ефективне відновлення мутантних фенотипів у генерації 1 F, важливо максимізувати шанси повних алелів LOF. При створенні мутантних ліній із використанням звичайних підходів загальною стратегією є націлювання на розщеплення Cas9 поблизу 5 'кінця кодуючих областей, щоб досягти передчасного припинення раннього трансляції кодуючої області білка. Гетерозиготи1 F ідентифікували б із мутаціями фазового зсуву, і цих тварин відібрали б для подальшої роботи, оскільки, як вважають, вони несуть нульові алелі. Оскільки стратегія формування використовує схрещування F0, наближення 5 'кінця цільової послідовності кодування буде дуже неефективним. Ембріони F0 мають мозаїчні зародкові лінії, і перехресні результати призводять до популяцій мутантів F1, які в основному є гетерозиготними сполуками 17. Оскільки масштабний аналіз підтверджує, що в середньому очікуване

    Нарешті, також важливо врахувати, скільки тварин 0 F створити при стрибках. Оскільки різна кількість тварин не переживе статевої зрілості, рекомендується створити більше 20 ембріонів, що містять трансплантати. Потрібно мати достатньо вижилих тварин, щоб забезпечити (1) отримання достатньої кількості обох статей та (2) передачу цих мутантних алелів на частоті, достатньо високій для їх використання.

    Використовуючи описаний тут протокол, при певній практиці гімнофіонічні ембріологи повинні мати можливість освоїти техніку трансплантації PGC за певної практики. Стадіювання повинно бути можливим не лише у інших земноводних, але й у інших організмів, що містять ПГК, які легко пересаджуються між особинами на ранніх стадіях ембріогенезу.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Автору нічого розкривати.

    Подяка

    Ця робота була проведена за підтримки гранту 5R21HD080684-02 від Національного інституту охорони здоров’я дітей та розвитку людини. Автор висловлює подяку Кену Чо за його постійний ентузіазм та підтримку. Автор також хотів би подякувати Брюсу Блюмбергу, використовуючи свою камеру, Ребекці Чарні, за критичне читання рукопису, а також Шону Макнамарі та Марсіну Влізлі в Національному ресурсі Xenopus (RRID: SCR_013731) за цінні розмови про годівлю X. tropicalis та режими добробуту тварин.