Підготовка якісного протоколу пінофосфатів інозитолу (переклад на німецьку)

Резюме

Пінофосфати інозитолу відіграють важливу роль у таких захворюваннях людини, як рак, діабет та ожиріння, проте точний механізм дії є суперечливим. Відсутність комерційно доступних пірофосфатів інозитолу робить докладні дослідження проблематичними. Тут ми описуємо простий протокол для отримання та виділення міліграмів інозитолпірофосфату.

Анотація

Міо-інозитол зустрічається в природі або у незмінному вигляді, або у більш складних фосфорильованих похідних. Серед останніх двох найбільш поширених в еукаріотичних клітинах є інозитол пентакісфосфат (IP 5) та інозитол гексакісфосфат (фітинова кислота або IP 6). IP 5 та IP 6 є попередниками молекул пірофосфату інозитолу, які містять один або кілька пірофосфатних зв’язків 1. Фосфорилювання IP 6 утворює дифосхоінозитол пентакісфосфат (IP 7 або PP-IP 5) та бісдіфосхоїнозитол тетракісфосфат (IP 8 або (PP) 2-IP 4). Досі вивчали пірофосфати інозитолу з усіх еукаріотичних організмів. Крім того, два різні класи ферментів, що відповідають за синтез пірофосфату інозитолу, високо зберігаються протягом еволюції 2-4.

Кінази IP 6 (IP 6 Ks) мають величезну каталітичну гнучкість, перетворюючи IP 5 та IP 6 у PP-IP 4 та IP 7, а потім, використовуючи ці продукти як субстрати, сприяючи виробленню складних молекул 5, 6. Нещодавно був виділений другий клас ферментів, що виробляють пірофосфати, у вигляді білка дріжджів VIP 1 (також відомий як PP-IP 5K), який здатний перетворювати IP 6 в IP 7 і IP 8 7,8.

Пінофосфати інозитолу регулюють багато різнорідних клітинних процесів, таких як секреція інсуліну 9, довжина теломер 10,11, хемотаксис 12, торгівля везикулами 13, гомеостаз фосфатів 14 та вивільнення кляпсу ВІЛ-1 15. Для цього класу молекул запропоновано два механізми дії. Вони можуть алостерично впливати на клітинну функцію, взаємодіючи з певними білками, такими як AKT 16. Альтернативно, пірофосфатна група може віддавати фосфат фосфорильованим білкам 17. Величезному потенціалу цієї галузі досліджень заважає відсутність комерційного джерела пірофосфатів інозитолу, що заважає багатьом вченим вивчати ці молекули та нову посттрансляційну модифікацію. На сьогодні доступні методи виділення пірофосфатів інозитолу вимагають складного хроматографічного апарату 18,19. Ці процедури використовують переваги кислотних станів, які можуть призвести до розщеплення пірофосфату інозитолу і, таким чином, до поганого відновлення. Крім того, громіздкі процедури знесолення після колон обмежують їх використання лише спеціалізованими лабораторіями.

У цьому дослідженні ми описуємо невибагливий спосіб утворення, виділення та очищення продуктів реакцій IP 6-кінази та PP-IP 5-кінази. Цей метод став можливим завдяки здатності електрофорезу в поліакриламідному гелі (PAGE) розчиняти сильно фосфорильовані інозитолові поліфосфати 20. Після ферментативних реакцій IP 6 K1 та PP-IP 5 K із використанням IP 6 в якості субстрату PAGE використовували для відокремлення утворених пізофосфатів інозитолу, які згодом елюювалися у воді.

Протокол

1. Ферментативна реакція - 1-й день (1 година вдень)

  1. Першим кроком є ​​підготовка 10-20 незалежних ферментативних реакцій, в яких IP 6 K1 або VIP1 перетворюють IP 6, пірофосфорильовані ізоформи.
  2. Ми використовуємо ферменти His-IP 6 K1 та GST-VIP1, очищені від кишкової палички за протоколом, описаним раніше 17,18.
  3. Підготуйте 50 мкл реакцій з 1x буфером реакції (30 мМ Hepes pH 6,8, 50 мМ NaCl, 6 мМ MgSO 4, 1 мМ DTT), 6 мМ фосфокреатину (PCr), 25 ОД/мл креатинфосфокінази (CPK), 5 мМ АТФ (Mg сіль), 0,3 мМ IP6, 0,05-0,1 мкг His-IP 6 K1 або GST-VIP1. Регулювання гучності за допомогою MiliQ ddH 2 O.
  4. Коротко обертають реакцію при температурі 37 ° С протягом ночі з обертанням.

2. Розливання та завантаження гелю з поліакриламіду - 2 день (4 години вдень)

  1. Поліакриламідний гель виготовляється з використанням скляних пластин довжиною 24 см, шириною 18 см та розпірних шайб шириною 1,5 мм. Зазвичай використовується 16 смуг або підготовча односмугова гребінець.
  2. Приготуйте суміш (50 мл/гель) із таким вмістом: 35,5% (мас./Об.) Акриламіду: бісакриламід 19: 1, 1X трис/борат/ЕДТА (TBE), 0,05% (мас./Об.) Персульфат амонію (APS), TEMED 0,05% (мас./Об.). Розлийте суміш між попередньо відлитими скляними пластинами, вставте гребінець і дайте полімеризуватися протягом 30-60 хвилин при кімнатній температурі.
  3. Після того, як гель полімеризується, перенесіть пристрої в холодильник і в 1Х ТБЕ приблизно 30-60 хвилин при подачі 200-300 вольт.
  4. Додайте 1X барвника OrangeG (10 мМ трис-HCl рН 7,0, 1 мМ EDTA, 30% гліцерину, 0,1% OrangeG) до кожної реакції. Підготуйте зразок із 2 нмоль IP 6 як стандартне контрольне навантаження.
  5. Кожну лунку ретельно промити запущеним буфером за допомогою шприца та голки 21G, щоб видалити осад, а потім завантажити гель. Уникайте навантаження на сторону свердловини.
  6. Пропустіть гель на ніч при 450-550 вольт (7 МАМФ/гель), доки смужка барвника OrangeG не буде на останніх 10 см від дна гелю.

3. Виділення ІР 7 - день 3 (4 години) та день 4 (6-7 годин SpeedVac сушіння)

  1. Розберіть гелевий апарат і обережно вийміть одну скляну пластинку, залишаючи гель поверх іншої. Відріжте невелику порцію гелю відразу над барвниковою стрічкою OrangeG внизу, використовуючи стандарт IP-6 та пробу, як у ілюстрація 1 показано.
  2. Забарвити вирізану частину гелю толуїдиновим синім (0,1% (мас./Об.) Толуїдиновим синім, 20% (мас./Об.) Метанолу, 2% (мас./Об.) Гліцерину) протягом декількох хвилин (1-3 хв) або вище з’являється пінофосфатна стрічка інозитолу. Попередньо покладіть скляну пластинку на верхню частину гелю, щоб запобігти висиханню незабарвленого гелю.

Смуга IP-7 повинна бути видимою, оскільки вона працює трохи повільніше, ніж стандарт IP-6. ATP, що працює швидше, ніж IP 6, також повинен бути видимим (Ілюстрація 1). Перенесіть забарвлену частину гелю в розчин, що знебарвлює (20% (мас./Об.) Метанолу), на кілька хвилин, змийте надлишок толуїдинового синього і поставте гель з нефарбованим гелем.

Якщо потрібна візуалізація вищих пірофосфорильованих ізоформ ізотитолу (IP 8 та IP 9), фарбуйте гель фарбувальним розчином толуїдинового синього протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Потім промийте толуїдиновий синій розчином для фарбування приблизно 15 хвилин.

4. Визначення концентрації та чистоти IP 7.

  1. Використовуйте 2-5 мкл відновленого зразка IP 7 на гелі PAGE, аналогічно розділам 2.2-2.5. Помістіть кілька розведень IP 6 (тобто 0,5, 1, 2, 4 нмоль) як стандарт концентрації та 4 нмоль полі-Р маркери. Після запуску гелю візуалізуйте ізоформи пірофосфату інозитолу шляхом фарбування та знебарвлення всього гелю розчином толуїдинового синього згідно з процедурою в розділі 3.2. (Малюнок 2А) описано.
  2. Після фарбування толуїдином концентрації можна визначити шляхом сканування гелю та порівняння різниці в інтенсивності між IP 6 та IP 7, використовуючи програмне забезпечення для візуалізації, таке як: B. Image-J, як у Малюнок 2B показано.

5. Репрезентативні результати:

Препаративне ферментативне перетворення IP 6 у 7 за допомогою IP IP 6 ферментів K1 та VIP1 можна легко виправити за допомогою аналізу PAGE (Ілюстрація 1). Завантаження IP 6 як регулювання розміру разом з фарбуванням гелем толуїдинового синього дозволяє ідентифікувати пірофосфорильовані похідні, оскільки вони діють повільніше, залежно від кількості фосфатних груп на інозитоловому кільці. Описаний вище спосіб дозволяє просте очищення ІР 7. Аналіз очищеного інозитолпірофосфату за допомогою PAGE показав чистоту нашого ІР 7 (Малюнок 2А). Цікаво, що 1/3PP-IP 5 ізомер продукту VIP 7 продукту VIP1 мігрує дещо повільніше, ніж 5PP-IP 5 ізомер IP 7, генерований IP 6 K1. Використання стандартів IP 6 дозволяє легко визначити концентрацію очищеного IP 7 (Малюнок 2B). Перш ніж використовувати IP 7 для подальших експериментів, можна оцінити його біологічну активність
(Малюнок 3). 5PP-IP 5 інкубують з VIP1 та з IP 7 фосфатазою DDP1 (дифосфоїнозитол поліфосфат фосфогідролаза). Очищені IP 7 - IP 8 VIP1 та IP 6 DDP1 регулярно очищаються (Малюнок 3) перетворений.

пінофосфатів
Ілюстрація 1:. Фарбування толуїдином за допомогою PAGE та виділення IP 7-Band-Der Частину гелю зі стандартом (IP 6) вирізали і фарбували розчином толуїдинового синього. Три смуги представляють (зверху вниз) IP 7, IP 6 та ATP. Потім фарбовану частину гелю вирівнювали з рештою гелю. Це дозволяє локалізувати частину гелю з IP 7, яка потім буде вирізана та очищена (пунктирна коробка).

підготовка
Рисунок 2: PAGE-аналіз продуктів реакції IP 6 K1 та VIP1. А) Аналіз IP 6 (4, 2, 1, 0,5 нмоль) з фарбуванням толуїдиновим синім використовували для визначення концентрації IP 7 як IP 6 K1 (5PP-IP 5), так і VIP1 (1/3PP-IP очищений 5) ) Реакції. Б) Аналіз діаграми розсіювання для визначення концентрації очищеного ІР 7. Концентрації визначали відповідно до інтенсивності смуги, обчисленої за допомогою програмного забезпечення ImageJ, порівняно з раніше визначеними кількостями ІР 6. Вісь X представляє інтенсивності, вісь Y - концентрації, виражені в нмолях.

пінофосфатів
Малюнок 3: Аналіз біологічної активності IP 7 Для того, щоб визначити якість очищеного IP 7, ми інкубували 5PP-IP 5 (IP 6 K1, генерований IP 7) з VIP1 або з IP 7 фосфатазою DDP1, а потім вирішили реагувати на PAGE. Фарбування DAPI та толуїдином показало очікуване вироблення IP 8 за допомогою VIP1 та перетворення IP 7 у IP 6 за допомогою DDP1.

Обговорення

Застосування інозитолпірофосфату в біохімії сильно обмежене комерційною недоступністю таких сполук та низькою чутливістю існуючих методів виявлення. Комбінація PAGE, що дозволяє розділяти молекули, що мають різну кількість фосфатних груп, і толуїдиновий синій (Ілюстрація 1), метахроматичний барвник, який пов'язує фосфатні групи, дозволяє легко виявляти ізоформи пірофосфату інозитолу, відкриваючи нові шляхи у дослідженнях 20.

Описане використання технології PAGE у пірофосфаті інозитолу для очищення продуктів ферментативної реакції, проведеної за допомогою IP 6 K1 або VIP1, є простим, економічним та надійним методом, що дозволяє отримувати великі кількості високоякісного IP 7. Описаний вище спосіб не обмежується простим очищенням IP 7, але незначні незначні модифікації описаного протоколу можуть дозволити очищення різних діапазонів пірофосфатів інозитолу. Вищі ізоформи фосфорильованого інозитолпірофосфату з більш ніж вісьмома фосфатними групами можуть бути більш помітними з ІР 7 або різними кількостями ІП 6, ніж субстрат 20,6. Цей інозитолпірофосфат можна виявити, збільшивши довжину кольору, а потім очистити (розділ 3.2). Крім того, використання IP 5 в якості субстрату для ферментативної реакції дозволить очистити PP-IP 5 та інші пірофосфати інозитолу гідроксильною групою на кільці інозитолу.

Як результат, цей невибагливий метод дозволяє надійно очищати міліграмові кількості інозитолпірофосфату за допомогою широко доступних інструментів і, таким чином, відкриває нові шляхи для цієї захоплюючої галузі досліджень.

Розкриття інформації

Жодних конфліктів інтересів не заявлено.

Подяка

Ми вдячні А. Річчо за корисні коментарі та за читання рукопису. Ця робота була підтримана фінансуванням Ради з медичних досліджень (MRC) для відділу клітинної біології та грантом Human Frontier Science Program (RGP0048/2009-C).