Поверхнева функціоналізація наночастинок для цілеспрямованої взаємодії з біомолекулами - PDF
1 Поверхнева функціоналізація наночастинок для цілеспрямованої взаємодії з біомолекулами Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора природничих наук (д-р рег. Нац.) Представлена на кафедрі біології, хімії, фармації Вільного університету Берліна, подана Dipl.-Chem. Мейке Роскамп з Папенбурга, січень 2010 року
2 1-й рецензент: проф. Д-р Сабіне Шлехт 2-й рецензент: проф. Суперечка Ганса-Ульріха Рейссіга про
4 доктор Я хотів би подякувати Йенсу Дернедде за приємну співпрацю у дослідженні наночастинок, що зв’язують селектин, та у вивченні токсичності наночастинок. Я хотів би подякувати Ілоні Папп за гарну співпрацю та велику готовність допомогти. Я також хотів би подякувати усім відділам обслуговування Інституту хімії та біохімії, особливо Dr. Йоганна Шпандля для ознайомлення з ІЧ-спектрометром та Ріти Фріз для проведення ТГА. Я хотів би подякувати Майклу Стасіяку за коректуру цього твору та за його моральну підтримку під час написання. Я хотів би подякувати студентам Неллі Рівас, Францишці Бухнер, Катері Хазін, Марейке Ноа та Крістіні Людерс за їх синтетичну підтримку. Я хотів би подякувати своїй найкращій подрузі Аннет Брунсен за підтримку, яку вона завжди надавала, незважаючи на велику відстань і позитивний вплив на мої організаторські здібності. Я дякую своїм батькам за підтримку, на яку я завжди міг покластися. Я хотів би подякувати Фріцу Вільгельму Верніке за прикрасу холодильника із зворотним холодильником, маленькі записки на моєму столі та екскурсії містом, за підтримку та терпіння.
5 Зміст Зміст 1 Мотивація 7 2 Вступ до робочої області Синтез та характеристика наночастинок Синтез наночастинок Характеристика наночастинок Поверхнева функціоналізація наночастинок Реакції обміну лігандів Реакції на периферії лігандів Адсорбція молекул на оболонці ліганду Комбінація декількох методів функціональної поверхні наночастинок Токсичність Огляд охоплюваної медичної області 40 3 Результати та обговорення Синтез наночастинок Синтез та характеристика колоїдів Au Синтез та характеристика колоїдів Ag Синтез та характеристика колоїдів Au/Ag-сплавів Синтез та характеристика колоїдів CdS Індукований пептидом Агрегація наночастинок Структура та властивості використовуваних пептидів Заряджені наночастинки як будівельні блоки для електростатичного розташування Управління та стабільність наночастинок у буферному VW05-індукованому розташуванні негативно заряджених НЧ Формоване наночастинками фібрильне утворення Селектин-зв’язуючі наночастинки 109 5
6 Зміст Залежність інгібування від ступеня сульфатування Відтворюваність значень IC 50 Вплив структури зв’язуючого ліганду Вплив пептидного зв’язку Вплив довжини ланцюга Вплив розміру наночастинок Порівняння впливу факторів, що досліджуються на значення IC 50 Дослідження ТЕМ Клітична токсичність НП при іммобілізації НП Полімерні волокна Короткий зміст та перспективи Короткий опис Експериментальна частина Скорочення Розчинники та реагенти Синтези Синтези NP Синтези реакцій обміну лігандів Ковалентна модифікація синтезів NP лігандів Прилади та методи вимірювання, що використовуються Діаліз Гель електрофорез ЯМР-спектрометр ІЧ-спектрометр Термогравіметричний аналіз (TGA) Трансмісійний електронний УФ-мікроскоп (ТЕМ) Спектрометр Конкурентний аналіз зв'язування на основі SPR Бібліографія Додаток 216 6
23 2 Вступ до області дослідження Рисунок 2.7: Виробництво наночастинок Au, координованих ліпазою, за допомогою хімічної хімії [77]. Дослідження кінетики 1,3-диполярного циклоприєднання між азидом та алкіном на поверхні золотих НЧ було проведено Тоде та Вільямсом (схема див. Рис. 2.8) [79]. На додаток до розчинника, заступники на алкін-кетоні, довжина ланцюга лінкера, тобто. H. сполучна частина молекули між азидною групою і поверхнею NP і щільністю азидних груп на поверхні частинок. Всебічного порівняння реакції у розчині та на поверхні частинок не проводилось, але швидкість перетворення здається дуже подібною [80]. Цікаво, що зміна щільності зайнятості функціональних груп на поверхні частинок мала більший вплив на отриманий вихід, ніж будь-який інший параметр, розглянутий у цьому дослідженні. Рисунок 2.8: Загальна схема утворення триазолу на золотових НЧ [79]. 23
45 2 Вступ до галузі глікокон’югованих наночастинок золота [153, 157] та наночастинок сульфіду кадмію [158] та вивчення їх антиадгезивних властивостей або, у випадку напівпровідникових наночастинок, їх придатності для маркування клітин. Метою цієї робочої групи є краще розуміння вуглеводно-вуглеводних взаємодій [159], а також вплив на опосередковані вуглеводами процеси адгезії клітин-клітин, такі як запальний процес. Частинки полімеру також можуть служити носіями для моно- та лігосахаридів. Хааг та ін. показав у 2008 р., що функціоновані галактозою частинки полігліцерину здатні інгібувати зв’язування селектину [160]. На додаток до залежності від ступеня функціоналізації частинок, у цій роботі було виявлено чітке поліпшення властивостей зв'язування після сульфатування залишків галактози. Це спостереження збігається з роботою Лінхардта та ін. спостереження за гепарином (див. вище). 45
67 []/(10 3 degcm 2 дмоль -1 залишок -1) 3 Результати та обговорення VW19 RR/нм Рисунок 3.25: Спектри CD 50 мкм VW19 і 50 мкм RR01 при рН 7,4. Більш детальний опис структур VW19 і RR01 як функції концентрації та значення ph можна знайти в публікаціях Pagel et al. можна взяти з [182, 183]. У таблиці 3.5 наведено розрахований чистий заряд пептидів як функцію значення рН. VW19 позитивно заряджений нижче рН 10 і негативно заряджений над ним. RR01 вже заряджений негативно з приблизно Ph 5. Тоді як VW19 має позитивний чистий заряд у нейтральних розчинах і, отже, вступатиме в привабливі електростатичні взаємодії з негативно зарядженими NP, RR01 має негативний чистий заряд у цьому діапазоні pH, що передбачає відразливі електростатичні взаємодії з негативно зарядженими NP. Для позитивно заряджених НЧ справедливе протилежне. З RR01 в цьому діапазоні значень рН відбуваються привабливі електростатичні взаємодії, тоді як з VW19 слід очікувати відразливих електростатичних взаємодій. Таблиця 3.5: Чистий заряд пептидів VW19 та RR01 при різних значеннях рН [179]. значення ph чистий заряд VW19 [е/пептид] чистий заряд RR01 [е/пептид]
88 3 Результати та обговорення Рисунок 3.43: Зображення TEM з координати MUDS. Au-NP (d = 6 нм) при pH 9 у 10-міліметровому буфері Tris/HCl (a) без і (b, c і d) з 10 мкм VW05. Поки НП без пептиду були виділені та відносно рівномірно розподілені на сітці ТЕМ, при наявності 10 мкм VW05 було видно чітку агрегацію частинок. На додаток до NP-пептидних агрегатів розміром кілька 100 нм, деякі концентрації та препарат, що лежать окремо, також можуть бути знайдені при концентрації та приготуванні цього пептиду. Порівняно із зображеннями ПЕМ з попередніх випробувань (рис. 3.40), структура заповнювачів місцями має певний порядок з короткого діапазону (див. Рис. 3.43, d), але далекобійного порядку частинок немає, незважаючи на значно поліпшену дисперсність частинок. Сушіння зразка під час підготовки сітки може призвести до ефектів агрегації, які не виникають у розчині. Отже, зразки, підготовлені таким чином, дозволяють робити лише обмежені висновки щодо ситуації 88 щодо стану агрегації компонентів
89 3 Результати та обговорення у розв’язанні. Видалення розчинника також може призвести до руйнування впорядкованих структур, якщо, як відомо із агрегатів NP-ДНК [104], високий відсоток структури зайнятий молекулами розчинника. Таким чином, ступінь упорядкованості NP-пептидних агрегатів у розчині не обов'язково повинен відповідати такому на таких підготовлених зображеннях ТЕМ. Записи Cryo-TEM мають ту перевагу, що зразок не сушать, а заморожують, так що зразок перебуває у стані, порівнянному з розчином, з огляду на відстань між компонентами, присутніми під час вимірювання. Кріо-ТЕМ-зображення координати MUDS. Au-NP та VW05 при pH 9 показані на малюнку 3.44 і, по суті, дають ті самі результати щодо агрегаційної поведінки NP та їх ступеня впорядкованості в агрегатах, як показано на малюнку 3.43. Рисунок 3.44: Кріо-ТЕМ-зображення з координатою MUDS 0,05 мкм. Au-NP (d = 6 нм) при ph 9 та різному збільшенні (a та b) без VW05 та (c та d) з 10 мкм VW05. 89
Тому для того, щоб мати змогу працювати над результатами та обговоренням, необхідна зміна розчинника. Спроби зробити це вже були неможливі в рамках цієї роботи. Рисунок 3.46: ТЕМ-зображення суміші координат MUDS 0,05 мкм, загартованої при 80 C. Au-NP та 10 мкм VW05. Ще одне цікаве спостереження було зроблено при обробці осаду ультразвуком. Раніше фіолетовий, помутнілий розчин знову став прозорим і червоним завдяки обробці ультразвуком. Фотографії суспензії агрегатів до та після ультразвукової обробки наведені на рисунку 3.47. Через короткий час (приблизно 10 хв) осад і фіолетовий колір відступили. Поки не з'ясовано, чи пов'язаний цей процес виключно з механічним подрібненням агрегатів або індукованою ультразвуком зміною пептидної конформації. Рисунок 3.47: Фотографії суміші координат MUDS 0,05 мкм. Au-NP з 10 мкм VW05 (a) до та (b) приблизно через 20 секунд ультразвукової обробки. 92
94 3 Результати та обговорення h, 6 h, 20 h max/nm c (sr05)/M Рисунок 3.49: Максимуми поглинання 0,05 µm MUDS координата. Au-NP в залежності від концентрації SR05 при рН 9 (10 мМ буфер Tris/HCl) безпосередньо після змішування компонентів і через 6 год і 20 год. Були привабливі електростатичні взаємодії між позитивно зарядженим пептидом SR05 та негативно зарядженими NP, що призвело до незначного збільшення поглинання в спектрах поглинання (див. Рисунок 3.49 та спектрів у додатку, розділ 8.1.5) та незначного збільшення гель-електрофорезу Уповільнення смуг NP із збільшенням концентрації пептиду (див. Малюнок 3.50). На відміну від випробувань з VW05, однак, опадів та значного зміщення максимуму поглинання не спостерігалося. Рисунок 3.50: Гель-електрофорез на сумішах координованих MUDS Au-NP та SR05 при рН 9, вгорі ліворуч: агарозний гель, підданий дії білого світла, внизу ліворуч: агарозний гель під впливом 254 нм УФ-світла, праворуч: таблиця із співвідношенням змішування нанесених зразків. Положення кишень позначено червоною лінією. 94
129 3 Результати та обговорення NP11 функціоналізували за допомогою енантіомеру аміну, іммобілізованого на NP10, а потім сульфатували. Значення IC 50 цих двох колоїдів (див. Таблицю 3.10) як для L, так і для P-селектину суттєво не відрізняються одне від одного. Отже, енантіомери мають ідентичні властивості зв’язування в цьому прикладі. У таблиці 3.11 наведено значення IC 50 двох подальших функціоналізованих амінопіраном колоїдів. NP12 та NP13 відрізняються наявністю сульфатної групи (позначено синім у таблиці 3.11). У той час як NP12 містить три сульфатні групи на ліганд, ліганд NP13 має лише дві з інакшою структурою. Таблиця 3.11: Значення IC 50 сульфатованих Au-NP. Діаметр серцевини NP NP становить приблизно 6 нм. Значення, позначені зеленим кольором, були визначені з іншою партією NP, але були математично скориговані для цієї таблиці. Назва інгібітора IC 50 L-селектин IC 50 P-селектин IC 50 E-селектин S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 460 pm N.I. S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 300 pm N.I. S 3 Na S3Na Au S 9 N H S3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. 129
132 3 Результати та обговорення Таблиця 3.13: Значення IC 50 сульфатованих Au-NP з лігандами, що несуть гідрофобні компоненти. Діаметр серцевини Au-NP становить приблизно 6 нм. Позначення інгібітора IC 50 L - селектин IC 50 P - селектин IC 50 E - селектин S 3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 130 pm N.I. S 3 Na NP pm 150 pm N.I. Au S 9 N H S 3Na S3Na Au S 9 N H S 3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. Цікаво, що координовані MUDS колоїди Au (NP18) також здатні інгібувати зв'язування L- та P-селектину. Недоліком Au-NP, що координується MUDS, є їх погана стійкість до агрегації при значеннях pH менше 9. Розчини Au-NP, що координуються MUDS, можуть вироблятися лише при дуже низьких концентраціях, але вони можуть зберігатися лише короткий час. Для експериментів, представлених тут, протягом 24 годин готували і досліджували 30 нмолярний розчин (на основі концентрації NP). Значення IC 50 для координат MUDS. Au NP з діаметром серцевини приблизно 6 нм наведені в таблиці 3.14. Для порівняння тут також були визначені значення IC 50 NP7 та сульфатно-грязьово-координованих Au NP (NP19) з діаметром серцевини приблизно 6 нм. Синтези NP18 та NP19 вже були представлені в розділі (схема обміну лігандами див. Рисунок 3.29). 132
134 3 Результати та обговорення NP з координованим цитратом Au NP, який також має карбоксилатні функції на їх поверхні. Поки MUDS коорд. Au-NP для L- та P-селектину IC 50 - значення в пікомолярному діапазоні не можуть інгібувати зв'язування селектину в присутності цитратної координати. Au NP можна спостерігати. Окрім негативно зарядженої підструктури, для досягнення хорошої спорідненості до зв'язування повинні відповідати інші вимоги. Для зв’язування недостатньо запропонувати негативно заряджену частинку в певному діапазоні розмірів. Поведінка зв'язування цитратної координати. Au-NP вже вказує на те, що виміряні результати не зумовлені неспецифічними взаємодіями між селектином та наночастинками. На рисунку 3.71 показано два додаткові приклади NP, які не виявляли жодного інгібуючого ефекту в аналізі конкурентного зв'язування. а) б) Au N N Au S H Рисунок 3.71: а) координата DMAP. Au-NP та b) Pol1-координата. Au NP 9.
21 Навіть при високих концентраціях NP, після інкубації незв’язуючих Au NP з L-селектином, відносне зв’язування 100% і, отже, не було інгібування. Як результат, відсутні вимірювані неспецифічні взаємодії між селектином та НП. Підсумовуючи, значення IC 50 у пікомолярному діапазоні були отримані для всіх досліджених тут полісульфатованих НЧ, незалежно від структури. Структура ліганду і, зокрема, просторове розташування груп, доступних для зв'язування з селектином, справляли сильний вплив на властивості зв'язування НП. При більш складних структурах також може бути отримана селективна поведінка зв'язування з L- та P-селектином. P-селективність спостерігалася особливо у лігандів, які були легко податливими і стерично менш вибагливими. Прості структури інгібували обидва селектини з однаковими значеннями IC 50. Надійний прогноз 9 Полімер Pol1 був синтезований Марі Вайнхардт. 134