Просторова кількісна оцінка наркотиків при ураженнях туберкульозу легень методом мікродисекції лазерного захоплення

Резюме

Тут ми описуємо протокол з використанням мікродисекції лазерного захоплення в парі з аналізом LC/MS для кількісного визначення просторового розподілу лікарських засобів у межах гранульом туберкульозу легенів. Цей підхід має широке застосування для кількісної оцінки концентрації лікарського засобу в тканинах з високою просторовою деталізацією.

Анотація

Вступ

Здатність просторово вирішувати та кількісно визначати рівні лікарських засобів має важливе значення для визначення того, чи потрапляють протитуберкульозні ліки до бактеріальних субпопуляцій в межах легеневих уражень при концентраціях стерилізації 1. Особливо важливим є проникнення ліків у некротичне ядро ураження (так званий казеум), визначення якого, як правило, містить найбільшу кількість паличок і, можливо, погано доступних препаратів через відсутність васкуляризації.

Традиційні методи проникнення в ураження, що оцінюють гомогенізацію вирізаних легеневих уражень з наступною екстракцією розчинником та аналіз рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (РХ/МС), є дуже чутливими та селективними щодо препаратів, що представляють інтерес. Однак ці методи забезпечують погану просторову інформацію, обмежену розміром вихідної гомогенізованої тканини. Підходи до зображень на основі мас-спектрометрії, такі як матрично-допоміжна лазерно-десорбційна іонізація (MALDI) 2, 3, десорбційна електророзпилювальна іонізація (DESI) 4 або екстракція поверхні з розширеною рідиною 5, 6, пропонують дуже просторово вирішені можливості візуалізації, але пряма кількісна оцінка може бути надзвичайно складною або неможливий через неоднорідні ефекти придушення іонів та різну ефективність вилучення аналітів з окремих клітин або тканин 7. Крім того, більшість прямих методів візуалізації тканинної МС за своєю суттю менш чутливі, ніж РХ/МС, через відсутність хроматографічного розділення ендогенних видів, що конкурують за іонізацію, та нижчу ефективність вилучення розчинника препарату з тканини.

Цей протокол описує потужну комбінацію просторового профілювання та повної кількісної оцінки LCM-LC/MS, пропонуючи абсолютні концентрації лікарських засобів у всіх відділеннях пропонованих гранульом туберкульозу. Ця методика також може бути застосована для визначення концентрації лікарського засобу в багатьох різних хворих тканинах для інформування про життєво важливе відкриття та розробку ліків.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Всі випробування на тваринах проводились згідно з Керівництвом Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин з дозволу Інституційного комітету з догляду та використання тварин NIAID (NIH), Бетесда, доктор медичних наук.

(1) Випробування на тваринах та збір тканин

У цьому розділі протоколу описуються процедури на тваринах та умови збору зразків рівня біобезпеки 3 (BSL3). Для детальних протоколів процедури аерозольного зараження мікобактеріями туберкульозу та управління лікарськими засобами протоколи у кроликів були описані раніше 11, 12 .

(4) Вилучення та аналіз LCMS

5. перевірка методу

Створіть гомогенат у контролі легеневої тканини, поєднуючи 1 частину легені, 2 частини PBS та 3-4 сталевих кульки. Збивайте легеневу тканину та буфер PBS протягом 5 хвилин при 1750 об/хв гомогенізатором бісеру.
Введіть гомогенат, додавши 10 мкл 1 мг/мл ДМСО етамбутолу в 990 мкл гомогенату, щоб створити кінцеву концентрацію 10 000 нг/мл (10 мг/мл) і вихору протягом 1 хвилини.
Створіть заморожений гомогенатний блок, заливши гомогенат у кріомольд і швидко заморозивши його на сухому льоду протягом 5 хвилин.
Приготуйте з блоку гомогенатів зрізи товщиною 25 мкм, як описано в 2.1-2.5.
Розсічіть тканину-мішень, як зазначено в кроках 3.2-3.10.
Додайте 10 мкл 1: 1 ацетонітрилу/води та 2 мкл буфера PBS у пробірки з мікророзсіченою тканиною.
Додайте 50 мкл екстракційного розчину в кожну пробірку. Етапи створення стандартної кривої та визначення концентрації препарату в гомогенатному блоці тканини 4.9-4.12.
Розрахуйте ефективність вилучення за такою формулою:

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Огляд підходу LCM-LC/MS наведено на рисунку 1показано. Після стерилізації тканини гамма-опроміненням усі подальші етапи (відсікання тканини) відбуваються поза умовами BSL3. Малюнок 2 показані ділянки біопсії ураження до та після тканини, виділеної з LCM. Некротичні та клітинні ділянки уражень туберкульозом можна легко ідентифікувати та виділити лише візуальним оглядом оптичних зображень (без необхідності посилання на сусідні тканини, гістологічно пофарбовані зрізи). Процес розтину створює чистий розріз з мінімальним руйнуванням навколишньої тканини, а розтинання 3 мільйонів мкм 2 (3 мм 2) кожної області, що представляє інтерес, займає приблизно 1 годину.

Ми застосували кількісну оцінку LCM-LC/MS просторово - багато існуючих та нових протитуберкульозних препаратів у легеневих ураженнях. Малюнок 3А показані зразки даних інфікованих МТБ кроликів, дозованих стаціонарним станом етамбутолом. LCM-LC/MS дозволили повністю визначити кількість препарату, розчиненого в межах казеуму, клітинних уражень та незалучених ділянок легеневої тканини. Спостерігалося, що ЕМВ проникає через вогнище ураження для досягнення концентрації стерилізації в межах некротичного казеуму. Відповідне зображення MALDI-MS, отримане в результаті продажу EMB із сусідньої тканини, показано на малюнку 3b. Якісні зображення MALDI-MS добре корелювали з кількісними даними LCM-LC/MS з нижчими концентраціями лікарських засобів, виявленими в некротичному казеумі порівняно з клітинною оболонкою. Дані LCM-LC/MS були перевірені шляхом прямого порівняння з гомогенатами тканин, проаналізованими за стандартними LC/MS.

ілюстрація 1 : Схематичний процес LCM-LC/MS. Біопсія легенів зайчика з некротичними ураженнями разом з оточуючими незалученими легенями збирається і заморожується. Кріосекції розрізають на тонких мембранах ПЕТ, а незалучені легеневі, клітинні та казеозальні ураження розтинають та ізолюють для кількісного визначення за допомогою РХ/МС. адаптовано від Zimmerman et al. 12 Клацніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 2 : Поразка (A, B) та незалучена легеня (C, D), оскільки вони з’являються під мікроскопом до (A, C) та після (B, D) мікродісекції. Області ураження казеози виглядають темнішими та "тріщинами" при скануванні оптичного зображення (А, зелений контур). Клітинне ураження світліше за кольором і має більш тверду структуру (А, червона облямівка). Легкі, що не беруть участь, слід пропальпувати принаймні на 5 мм від кордону ураження та мати червоно-рожевий колір (С, блакитний контур). Масштабні смужки (чорні, сині та фіолетові) = 400 мкм. Зверніть увагу, що слід вибирати лише ділянки незалучених легенів, щоб уникнути включення альвеолярних просторів та бронхіол, захоплених на всій поверхні тканини (див. Г). Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Розсічена площа (мкм - 2)	Виміряна концентрація ЕМВ (Нг/г) (n = 3)	Відновлення ЕМБ (%) (n = 3)
3 мільйони	10633 (± 404)	106 (± 4)
5 мільйонів	10057 (± 1132)	101 (± 11)
10 мільйонів	10563 (± 1128)	105 (± 11)

Таблиця 1: Ефективність екстракції методу LC-LC/MS для кількісного визначення ЕМВ у легенях. Повне відновлення ЕМВ реєструвало легування ЕМВ гомогенатом розсіченої легеневої тканини для всіх оцінених обсягів тканини.

Ідентифікатор кролика	LC/MS EMB (нг/г)	LCM-LC/MS EMB (нг/г)	Різниця (%)
899	2910	3320	14-е
904	2010 рік	1870 рік	-7-й
911	2150	2370	9

Таблиця 2: Порівняння кількісної оцінки ЕМВ незалучених біоптатів легенів у 3 дозованих кроликів за допомогою LCM-LC/MS. та LC/MS Еквівалентні концентрації лікарських засобів, виявлені методами, і відсутність втрати сигналу при деградації або аспірації під час процесу LCM-LC/MS.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Необхідно просторово вирішену кількісну оцінку лікарських засобів у межах легеневих туберкульозних уражень, щоб визначити, чи досягла концентрація наркотиків стерилізуючих концентрацій бактеріальних популяцій, що мешкають у різних відділах ураження. Описаний тут метод LCM-LC/MS дозволяє забезпечити абсолютну кількісну оцінку протитуберкульозних препаратів у всіх суб’єктів ураження, включаючи багатий бактеріями казеум, із загальною кількістю лише 1-3 ділянок тканини. Традиційна гомогенізація тканин та підходи LC/MS до кількісної оцінки препарату в тканині часто не мають просторових особливостей для вирішення конкретних відділів ураження, і навіть коли це можливо, існує значний потенціал для забруднення міжклітинними та некротичних ділянок ураження під час ручної екстракції.

Протоколи фарбування тканин зазвичай використовуються до LCM для протеомічних застосувань, щоб забезпечити легку ідентифікацію ділянок тканини, розташованих у популяціях клітин. Звичайні гістохімічні плями, такі як B. H&E не сумісні з кількісним визначенням лікарських засобів, оскільки багато етапів промивання розчинниками переносять препарат із ділянки тканини в іншу. Сусідні заготовки можна фарбувати H&E і використовувати як керівництво для мікродисекції. Однак це, як правило, не є необхідним, оскільки відділи ураження можна переглянути під стандартним мікроскопом LCM з яскравим полем (Рисунок 2) можна вирішити.

Оптимізація кроків різання та мікродисекції має вирішальне значення для успішної кількісної оцінки ураження. Під час розробки методу ми оцінили два різні мембранні матеріали - поліетилентерефталат (PET) та поліетилен-нафталат (PEN) як підкладки для збирання зрізів тканини для мікродисекції. ПЕН-мембрани зазнали підвищених статичних зарядів порівняно з ПЕТ-мембранами, і приблизно 30% усіх розсічених ділянок тканини було втрачено через статичне тяжіння між мембраною та розсіченою областю тканини. З цієї причини ПЕТ-мембрани були обрані для майбутніх дисекцій через суттєво зменшеного статичного притягання (лише 5% областей, розсічених з ПЕТ-мембран, були втрачені під час LCM).

Щільність розсічених ділянок тканини також є важливим фактором при визначенні рівня препарату на основі площі або обсягу тканини. Це особливо важливо для біопсій легенів та уражень, при яких незалучені ділянки легеневої тканини мають загальну нижчу щільність, ніж клітина та казеум (менша кількість тканин, що мають однакову відносну площу) через наявність безлічі відкритих бронхіол та альвеолярних просторів. Ефекти цієї різниці в щільності можна пом'якшити, ретельно оглянувши відкриті ділянки, включаючи їх у накопичену площу зібраних тканин (як показано на малюнку 2показано).

Іншим обмеженням є те, що представлений метод LCM-LC/MS лише кількісно визначає загальну концентрацію лікарського засобу в ізольованій тканині (разом із усіма методами гомогенізації тканин, екстракцією розчинника та кількісною оцінкою LC/MS) і не розчиняє концентрації зв’язаного з білком лікарського засобу з незв’язаних розривів. Мікродіаліз є альтернативним підходом до кількісної оцінки незв’язаного лікарського засобу в тканині і дозволяє точно визначити концентрацію вільних лікарських засобів, що досягає позаклітинних популяцій бактерій 13. Однак цю методику найкраще застосовувати як доповнюючий підхід, оскільки вона не має просторових специфік LCM-LC/MS і лише кількісно визначає рівень розчинних препаратів в ієрархії позаклітинної тканинної рідини, а не внутрішньоклітинний вміст.

Ми вперше поєднали LCM та LC/MS для просторової кількісної оцінки антибіотиків на місці туберкульозної інфекції. Методологія надзвичайно потужна, оскільки може бути застосована до будь-якого маломолекулярного препарату на будь-якій стадії захворювання. Насправді, нещодавно ми кількісно визначили кандидата протигрибкового препарату на миші-моделі черевного кандидозу 14. Диференціальне розподіл ліків на гетерогенні відділи пухлини (включаючи некротичні ядра) є основною проблемою при лікуванні раку та критичною сферою досліджень щодо виявлення ліків від раку 15. LCM-LC/MS ідеально підходить для вирішення цих питань. Крім того, LCM-LC/MS корисний для відкриття біомаркерів для кількісної оцінки метаболічних, ліпідомічних та протеомічних змін, що відбуваються в ділянках тканин та клітинних популяціях під час патогенезу захворювання.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.