Протокол аналізу енерговитрат Danio Rerio з високою пропускною здатністю (переклад на німецьку)
Анотація
Вступ
В даний час миша є домінуючою моделлю для дослідження ожиріння. Короткий інтервал генерації та генетичні засоби, доступні у миші, на сьогоднішній день не мають собі рівних. Однак даніо також має короткий інтервал генерації (3-4 місяці) і навіть перевершує мишу за допомогою простих генетичних маніпуляцій 1,2. Данио підтримує майже 90% генів ссавців, тоді як миша значно перевищує кількість потомства та потенціал для використання на генетичних та лікарських скринінгах 3.
Щоб розкрити потенціал моделі даніо для досліджень ожиріння, необхідно розробити тести для вивчення факторів, що впливають на регулювання ваги, включаючи витрати енергії. Як метаболіти, кисень переробляється за допомогою β-окислення і споживається цикл трикарбонової кислоти, і утворюється NADH 2. Таким чином, NADH 2 є прямим показником потоку метаболітів через метаболічні шляхи (окислення метаболітів). У пойкілотермах Н + витікає через внутрішню мітохондріальну мембрану, окислення NADH 2, відокремлене від синтезу АТФ, у 4-5 разів менше, ніж у теплокровних тварин 4. Відповідно, у даніо NADH 2 дуже міцно приєднується до продукції АТФ завдяки окисному фосфорилюванню підключений. Тут ми описуємо тест, який вимірює вироблення NADH 2 у личинках даніо як проксі для споживання енергії 5.
Споживання кисню є золотим стандартом для вимірювання витрат енергії. Однак найкраще використовувати високий пропускний потенціал аналізу даніо, оскільки споживання енергії має бути доступним для високої пропускної здатності. Системи споживання кисню, які залежать від циркуляційної системи із закритою камерою, обмежені в пропускній здатності кількістю присутніх камер 6. Аналізи споживання O 2 на відкритому повітрі/виробництва CO 2 також застосовувались у даніо 5.7. Ці 96-лункові плити під відкритим небом від BasisD Systems доступні для високої продуктивності. На жаль, газообмін з навколишнім середовищем обмежує чутливість цих досліджень. Нещодавно ми опублікували застосування аналізу, який контролює NADH 2 за допомогою окислювально-відновного індикатора alamarBlue 5. Цей тест долає обмеження пропускної здатності та чутливості в загальних аналізах споживання кисню у даніо.
Данио стає все більш важливою моделлю для вивчення енергетичного гомеостазу всього тіла. Частково тому, що даніо є доступним у майбутньому за допомогою генетичних скринінгів та скринінгів наркотиків. Крім того, можна швидко застосовувати цілеспрямовані генетичні маніпуляції, включаючи надбавки та втручання. Раніше ми вже показали, що цей тест можна поєднати з доставкою ліків для ванни та генетичною добавкою або нокаутом для виявлення сполук та генів, які змінюють швидкість метаболізму 5. Крім того, цей тест слід використовувати для отримання переваг високої пропускної здатності, притаманних даніо.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
ПРИМІТКА: Цей протокол відповідає рекомендаціям Управління відповідальних досліджень Університету Арізони та схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин
1. Розведення та утримання ембріонів данини
2. Приготувати тест-розчин
- Приготуйте досліджуваний розчин згідно з таблицею 1. Розчин для аналізу стерильних фільтрів із використанням фільтра 0,22 мкм. Перед початком тесту прогрійте стерильний розчин для тестування на водяній бані з температурою 28,5 .5С.
| компонент | % Від загальної кількості | Об'єм (ul/10 мл) |
| 60x Е3 ембріон середній | 1,667 | 166,7 |
| Подвійний деіонізований (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Аламар блакитний- | 1 | 100 |
| 400 мМ NaOH | 1 | 100 |
| ДМСО | 0,1 | 10 |
Таблиця 1 Аналіз середовища
4. Оцініть відносну зміну флуоресценції, пов’язану з лікуванням
- Зміна флуоресценції з кожного розрахунку також шляхом віднімання флуоресценції в момент часу 0 від флуоресценції в кінці дослідження. Колодязі без риби (заготовки) повинні мати значення, близькі до 0, значно нижче значень свердловин, що містять рибу.
Зміна флуоресценції = флуоресценція в кінці - флуоресценція в момент часу 0 - Щоб визначити відносну зміну флуоресценції, обчисліть середню зміну флуоресценції для контрольних ям, потім поділіть зміну флуоресценції кожну на середню зміну флуоресценції для контрольних ям. Варто зазначити, що контроль може бути як контролем транспортних засобів, так і генетичним контролем.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Аналіз розчину нефлуоресценції за відсутності ембріональних риб (1) збільшувати. Однак тест дуже чутливий до незначних змін швидкості метаболізму в свердловині. Одна риба в криниці створює чіткий сигнал з порожніх лунок протягом 1 години (потрібна передплатна підписка. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Бактеріальне або грибкове забруднення значно обмежить застосування цього аналізу. Метиленовий синій у середовищі зародка Е3 обмежує можливість зараження грибками. Протягом всього періоду вирощування ембріонів важливо дбайливо видаляти мертві ембріони двічі на день. Крім того, важливо ретельно проаналізувати ембріони за допомогою стерильного середовища E3 Embryo Medium у день початку дослідження. Ці 2 етапи обмежують можливість бактеріального забруднення ембріонів. Включення порожніх лунок, описаних на кроці 3.2, дозволяє виявити будь-яке бактеріальне забруднення. Бактеріальне забруднення, яке дає вимірюваний сигнал, є рідкістю. Однак якщо порожні лунки показують надійний сигнал, аналіз слід повторити, слід подбати про підтримання чистоти ембріонів. Якщо користувач очікує, що забруднення відбудеться до запліднення, ембріони можуть бути відбілені, як описано вище (с. 22) 10. Як варіант, якщо експериментатор підозрює, що забруднення відбувається після збору, користувач може E2 повернути пеніциліном та стрептоміцином використовувати ембріони до 4 dpf (стор. 23) 10.
Хоча цей тест є цінним для використання в ембріонах, ми не досліджували його дійсності у дорослих даніо. Ми підозрюємо, що всі функції цього тесту будуть обмежені у дорослих риб через погане проникнення тканин AlamarBlue. Крім того, під час годування риб кишкова флора може генерувати глибокий сигнал, який не має значення для метаболізму риб. Таким чином, цей тест заснований на застосуванні в яєчному жовтку, що годує ембріональну рибу. Відносна бездіяльність ембріональних риб пропонує унікальну перевагу, оскільки це обмежує мінливість, яка буде пов’язана з енергетичними витратами, спричиненими активністю 11. Отже, цей тест є унікальним інструментом для вивчення швидкості метаболізму у відповідь на генетичні або фармакологічні маніпуляції в цілій системі тварин.
Данио швидко стає провідною моделлю метаболічних розладів, що супроводжують ожиріння. Насправді є опубліковані 12,13 моделі як трансгенного, так і пов'язаного з дієтою ожиріння даніо. Подібно до моделей мишей, ожиріння, спричинене дієтою у даніо, збільшувало рівень тригліцеридів у сироватці крові та накопичення ліпідів у печінці 12. Крім того, корми даніо збільшували рівень глюкози натще, що свідчить про непереносимість глюкози 14. Використовуючи описану тут, ми показали, що попередня обробка метформіном, Сенсибілізатор інсуліну, збільшує швидкість метаболізму у відповідь на лікування 5 інсуліном. Таким чином, даніо може виявитись ідеальною моделлю для цілої тварини для виявлення препаратів, що покращують чутливість до інсуліну (ембріон), та встановлення їх ефективності у позбавленні ожиріння від інсулінорезистентності (дорослі).
Розвиток генетичних та дієтично обумовлених моделей ожиріння даніо, які імітують фенотипи, що спостерігаються у ожирілих ссавців, створює поштовх для ініціювання гибелі даніо, зосереджених на метаболічних захворюваннях. Доступні аналізи високої продуктивності для повного оцінювання значення моделі даніо для вивчення енергетичного гомеостазу. Інноваційні інструменти, що дозволяють здійснювати фагічну оцінку руху двигуна для екранів, орієнтованих на споживання енергії, тоді як тести накопичення ліпідів з високою пропускною здатністю призведуть до досліджень гомеостазу ліпідів у всьому тілі 15-17. Аналіз, який ми тут описуємо, є високопродуктивним інструментом для оцінки участі генів, сполук або їх взаємодії у енергетичних витратах всього організму.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.