Шлях заряду затворного калієвого каналу, пов’язаного з епілепсією, приймає хімічні ліганди
- предметів
- реферат
- вступ
- Результати
- Основні ролі консервованого фенілаланіну (F137) в активності ztz240
- Ідентифікація найбільш критичних залишків у KCNQ2-VSD
- Структурна модель прив’язки ztz240 до KCNQ2-VSD
- Відкриття нових активаторів для кріпильної кишені ztz240
- Антиепілепсийна активність активаторів, спрямованих на шлях заряду воріт
- обговорення
- Додаткова інформація
- Файли PDF
- Додаткова інформація, Рисунок S1
- Додаткова інформація, Рисунок S2
- Додаткова інформація, Рисунок S3
- Додаткова інформація, Рисунок S4
- Додаткова інформація, Малюнок S5
- Додаткова інформація, Рисунок S6
- Додаткова інформація, таблиця S1
- Додаткова інформація, таблиця S2
- Відео
- Додаткова інформація, фільм S1
Відео: Огляд та встановлення вантажної стійки XL на Jeep Wrangler Hitch (1987-2016 YJ, TJ & JK) (листопад 2020).
предметів
реферат
вступ
Результати
Основні ролі консервованого фенілаланіну (F137) в активності ztz240
Ідентифікація найбільш критичних залишків у KCNQ2-VSD
F137 знаходиться в середині сегмента S2 KCNQ2 VSD. Ми розробили більше мутантів для залишків, які вистилають VSD. Серед функціональних мутацій E130A, I134A, G138A, R207W та R210A різко знизили потенціюючу активність ztz240 у всіх трьох основних аспектах. Вони зменшили збільшення коефіцієнта поточної амплітуди назовні (I/I 0) і запобігли або послабили зсув лівої кривої ШВ (ΔV 1/2) та уповільнення дезактивації (рис. 2). Майже перекриваються хвостові струми цих мутантів із ztz240 та без нього чітко демонструють знижений вплив на дезактивацію (додаткова інформація, таблиця S1). Навпаки, мутації S105A та M174A гасили лівий зсув кривої GV, але не зменшували співвідношення I/I 0 або запобігали уповільненню дезактивації (рис. 2 та додаткова інформація, таблиця S1). Виявлення кількох основних залишків додатково показує важливість VSD для активності ztz240.
Визначення найбільш критичних залишків у KCNQ2-VSD для активності ztz240. (A) Репрезентативні сліди ідентифікованих критичних мутантів з 10 мкМ ztz240 і без. (B) Вплив 10 мкМ ztz240 на амплітуду зовнішнього струму мутантів VSD (n> 3). Кожне місце мутації вказується на основі прогнозованих трансмембранних областей. Пунктирна лінія позначає рівень потенціювання 10 мкМ ztz240 на каналі KCNQ2 дикого типу. Потенціал випробування становить +50 мВ. (C) Вплив 10 мкМ ztz240 на V 1/2 мутантів VSD (n> 3). Δ V 1/2 вказує на зміну V 1/2 після застосування ztz240. ΔV1/2 = V1/2 у присутності ztz240 - V1/2 в контролі.
Структурна модель прив’язки ztz240 до KCNQ2-VSD
Оскільки експериментальні структури KCNQ2 та його комплексів з іншими лігандами не визначені, важко побудувати структурну модель взаємодії ztz240-KCNQ2. Відповідно, ієрархічна стратегія була використана для побудови структурної моделі шляхом широкого використання моделювання гомологій, молекулярного стикування та моделювання MD у поєднанні з мутагенезом та електрофізіологічними визначеннями. Результат мутагенезу свідчить про те, що потенційна кишеня зв'язування ztz240 знаходиться у VSD, а не в інших доменах (рис. 1). Подальші електрофізіологічні експерименти показують, що ztz240 зв'язується з VSD у відкритому стані (додаткова інформація, рис. S3). Тому за допомогою Discovery Studio 2.6 (додаткова інформація, рис. S1B) ми спочатку створили тривимірну (3D) модель для трансмембранного домену KCNQ2 на основі структурної інформації відкритого каналу Kv1.2 29, 30, 31).
Модель облігації ztz240 з VSD. (A, Б) Загальні (A) і детально (B) Погляди на взаємодію між ztz240 та VSD. ztz240, а залишки показані у вигляді куль і паличок. Атоми вуглецю, кисню, азоту, хлору, фтору та водню в ztz240 пофарбовані у світло-блакитний, червоний, темно-синій, зелений, оранжевий та білий кольори відповідно. Для наочності показано лише кілька ключових атомів водню. Водневі зв’язки або електростатичні взаємодії позначаються червоними лініями. Взаємодія CH-π та галогенний зв’язок позначені чорною та зеленою лініями відповідно. (C) Структура зв'язуючої кишені, вилучена зі структурних моделей комплексів ліганд-VSD. Для ясності ліганди були видалені. Поверхня мішка зображена жовтим кольором. На правій стороні показано три поперечні перерізи сумки ззовні. Залишки відображаються у вигляді паличок. "Out" і "In" позначають зовнішню і внутрішню сторони клітинної мембрани.
Більшість критичних залишків, що вистилають кишеню для зв'язування, знаходяться в S2 і S4, таких як E130, I134, F137, G138, R207 і R210, тоді як дуже мало залишків в S1 і S3 впливають на з'єднання, такі як S105 і M174 (рис. 3)), які не зберігаються в ізоформах KCNQ. Для подальшої оцінки ролі залишків у зовнішніх сегментах S1 та S3 в активації ztz240 решту залишків, за винятком тих, що перелічені в 2B та 2C, досліджували за допомогою сканування аланіну, і жоден з них суттєво не впливав на активність ztz240 ( Додаткова інформація, таблиця S1)). Ці додаткові мутації та електрофізіологічні визначення ретроспективно підтверджують нашу модель зв’язування ztz240-KCNQ2.
Модель взаємодії ztz240-KCNQ2 чітко описує широку кишеню VSD, яка простягається від позаклітинної гирла VSD до R210 (рис. 3C). Ця можлива кишеня для зв'язування ztz240 у KCNQ2 частково перекривається з відповідними областями шляхів заряду затвора химерних каналів Shaker та Kv1.2-2.1, хоча вона є більш експансивною та глибшою (1A та 3C) 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15. Цей висновок узгоджується з попередніми дослідженнями, які свідчать про те, що VSD протоків Kv може бути місцями, що піддаються наркотикам 19, 20. Наше дослідження також виявило, що шлях заряду затвора KCNQ2 може мати нову функціональність, яка виступає в якості прямого зв'язуючого кишені для існуючих та нещодавно розроблених активаторів, таких як ztz240 та нових сполук, відкритих у цьому дослідженні (див. Нижче).
Відкриття нових активаторів для кріпильної кишені ztz240
Структурний віртуальний скринінг визначає активатори з різними хемотипами. (A) Збільшення амплітуди зовнішнього струму в присутності сполуки, як зазначено. Потенціал випробування становить -10 мВ. Пунктирна лінія позначає рівень піднесення до степені 1 (тобто відсутність піднесення до ступеня). (B) Криві реакції доза-відповідь YG002, YG025 та YG027 (n> 3 для кожної точки даних). (C) Хімічні структури виявлених активаторів. Фрагменти, орієнтовані на внутрішньоклітинний кінець ВСД, виділені оранжевим кольором. (D) Загальний вигляд накладених моделей зв'язування дев'яти ідентифікованих активаторів з VSD.
Антиепілепсийна активність активаторів, спрямованих на шлях заряду воріт
Первинний скринінговий аналіз проти епілепсії проводили для оцінки активності цих сполук у мишей за допомогою моделі судом, викликаної максимальним електрошоком (MES). Серед перевірених активаторів ztz240, YG007 та YG018 показали ступінь захисту> 50% і тому були відібрані для подальшого дослідження в модельованих MES та пентилентетразолом (PTZ) моделях нападів (додаткова інформація, таблиця S2). Ретигабін було припинено як позитивний контроль. Всі три сполуки показали чудову протиепілепсичну активність в обох моделях. У моделі судом, викликаної MES, введення однієї дози трьох сполук суттєво запобігало подовженню тонічних задніх ніг. Показники захисту (100%, 90% та 90%) порівнянні з показниками ретигабіну (табл. 1). У PTZ-індукованій моделі судом три сполуки виявляли протиепілепсичну активність, порівнянну з активністю ретигабіну. Одноразова доза цих сполук не тільки суттєво затримувала латентність клону, але й знижувала частоту генералізованих тоніко-клонічних нападів (GTCS) та смертність (табл. 2).
обговорення
Шлях заряду затвора каналу KCNQ2 приймає хімічні ліганди. (A) Детально про те, як активатори взаємодіють та впливають на R207 та R210, коли вони відкриті, на прикладі ztz240 та YG002. Активатори заповнюють простір між R207 і R210. Пунктирними лініями позначено взаємодію між активаторами та R210. (B) На кресленні показано, як хімічний ліганд діє на шлях заряду затвора, перебуваючи в заряді затвора і не даючи аргініну переходити в його низхідний стан.