Сигналізація ShcA-LRP Контроль проліферації клітин та захист від них

Наукова довідка

Білок, пов’язаний з рецептором ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ), належить до сімейства гена рецептора ЛПНЩ. Таким чином, він бере участь в ендоцитозі ліпопротеїдів, багатих ApoE. Було показано, що LRP може також брати участь у контролі процесів внутрішньоклітинної сигналізації. Миші, у яких дефіцит LRP-1, особливо на рівні VSMC, мають підвищену сприйнятливість до розвитку атеросклеротичних уражень. Ці ураження характеризуються, зокрема, гіперпроліферацією гладком’язових клітин (ХМЛ) з активацією сигнального шляху PDGF (фактор росту, що походить від тромбоцитів) та підвищеною експресією Фосфо-Ерка, активатора клітинної проліферації. [1]. Крім того, рецептор PDGF і LRP здатні функціонувати в комплексі, активація рецептора PDGF веде до фосфорилювання тирозину другого мотиву NPxY, розташованого в цитоплазматичному домені LRP [2].

Ці результати показують, що LRP контролює проліферацію клітин та шлях PDGF та захищає від атеросклерозу. Залишається з’ясувати, як LRP здійснює цей контроль.

Формування атеросклеротичних вогнищ характеризується створенням середовища з високим мітогенним потенціалом, багатим на такі фактори росту, як PDGF BB, IGF-1 (інсуліноподібний фактор росту). Зв’язування цих факторів з їх рецепторами дозволяє фосфорилювання останніх та набір сигнальних білків, що призводить до активації каскаду MAPK. Це призводить до фосфорилювання ERK та проліферації клітин.

ShcA (гомологія Src та колаген) - це білок-адаптер, що існує у трьох ізоформах (p66, p52 та p46), здатних передавати активацію цих рецепторів каскаду MAPK. ShcA може зв’язуватися з фосфорильованими залишками цитоплазматичної частини активованих рецепторів. Поєднання Shc з рецептором є необхідною умовою фосфорилювання та активації Shc, що, таким чином, служить опорною точкою для набору сигнальних молекул. В даний час каскад Shc: Grb2: Sos: Ras, який в кінцевому підсумку призводить до фосфорилювання ERK і проліферації клітин, є найбільш відомим сигнальним шляхом нижче за ShcA [3].

Також було показано, що ShcA зміг зв’язатися з фосфорильованим LRP на його цитоплазматичній частині [4]. Роль цієї фізичної взаємодії між ShcA та LRP у проліферації клітин та утворенні атеросклеротичних уражень досі невідома.

Метою цього проекту є визначити, чи керує сигналізація ShcA-LRP проліферацією клітин, та визначити in vitro та in vivo, за допомогою яких механізмів комплекс LRP-ShcA впливає на це регулювання.

Цілі

Завдання 1: Характеризуйте in vitro роль LRP у активації ShcA

Завдання 2: Характеризуйте значення in vivo значення ShcA у розвитку атеросклеротичних уражень у мишей (миші з дефіцитом ShcA у VSMC або миші з дефіцитом ShcA в ендотеліальних клітинах).

Результати

Завдання 1: Підхід in vitro

Наявність LRP необхідна для активації ShcA ?
Для відповіді на це запитання ми маємо ембріональні фібробласти миші в лінії, що експресує LRP (MEF LRP +/+) або дефіцит LRP (MEF LRP -/-).
Наші попередні результати (отримані шляхом фракціонування клітин) показують набір ShcA до мембрани в MEF LRP +/+, після стимуляції клітин інсуліном, фактором росту із використанням внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, загальних для IGF-1 (Фігура 1). Навпаки, у клітинах з дефіцитом LRP ShcA вже присутній на рівні мембрани в базальному стані і переходить у цитозольний відділ після стимуляції інсуліном (Фігура 1).
Таким чином, LRP впливає на внутрішньоклітинний обіг ShcA після стимуляції інсуліном.

контроль

Оскільки фосфорилювання ShcA необхідне для вербування Grb2 та для активації MAPK нижче за течією, ми також досліджували стан фосфорилювання ShcA до тирозину. Попередні результати показують фосфорилювання ізоформи р66 ShcA в MEF LRP +/+, яке збільшується через 10 хвилин стимуляції IGF-1 (20 нМ). Цього фосфорилювання немає у MEF LRP -/- (малюнок 2). Стан фосфорилювання ізоформ р52 та р46 не можна інтерпретувати, оскільки їх міграція маскується імуноглобулінами.
LRP, отже, буде необхідним для фосфорилювання ізоформи p66sn`A після стимуляції IGF1.

Чи впливає наявність LRP на активацію білків-партнерів ShcA та залучених до каскаду проліферації ?
Щоб відповісти на це питання, ми простежили стан активації елементів, що беруть участь у каскаді ShcA: Grb2: Sos: Ras: Erk, нижче за ShcA, після стимуляції IGF-1 в LEF LRP -/- та LRP + /+.
Аналіз (вестерн-блот) експресії Grb2 показує збільшення його експресії після стимуляції IGF-1 з максимумом через 30 хвилин у MEF LRP +/+. У LRP -/- MEFs зустрічається подібна кінетика, але кількісно експресія Grb2 помітно знижується (малюнок 3).

Аналіз (вестерн-блот) експресії фосфо-Ерк показує збільшення експресії після стимуляції IGF-1 з максимумом від 5 до 30 хвилин у MEF LRP +/+. У MEF LRP -/- зустрічається подібна кінетика, але кількісно експресія фосфо-Ерк чітко знижується (малюнок4).

LRP, таким чином, бере участь в активації білків-партнерів ShcA, що беруть участь у каскаді проліферації після стимуляції IGF-1.

Чи є рецептори LRP, ShcA та IGF частиною одного сигнального комплексу ?
Для того, щоб зрозуміти, як LRP контролює каскад ShcA-Grb2-Erk1/2, ми досліджуємо, з якими партнерами LRP безпосередньо взаємодіє.
Завдяки експериментам з коімунопреципітацією ми змогли продемонструвати в VSMC людини після стимуляції IGF-1 утворення комплексу між IGFR та LRP. Цей результат спостерігається також у LRP +/+ MEFs та LRP -/- MEFs, ретрансфікованих цитоплазматичним доменом LRP-1, з тією різницею, що цей комплекс вже присутній у базальному стані (малюнок 5).

LRP та рецептор IGF-1, отже, є частиною одного сигнального зомплекса.

Завдання 2: Підхід in vivo - генерація мишей ShcAflox/flox

Висновок - Продовження проекту

Додаткові результати, отримані з минулого року, дуже підбадьорюють і демонструють комплекс LRP-IGFR-ShcA як нового та оригінального гравця у контролі внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, введених у дію фактором росту, що бере участь у розвитку атеросклеротичних уражень.
Фенотиповий аналіз мишей, які мають дефіцит ShcA, особливо на рівні гладком'язових клітин або ендотеліальних клітин, буде дуже корисним для характеристики in vivo ролі, яку відіграє ShcA у розвитку атеросклеротичних уражень. Ці два підходи in vitro та in vivo доповнюють один одного.

Перспектива: мета 1Формування комплексу LRP/IGFR

Для того, щоб визначити, чи взаємодія між LRP та ShcA є наслідком прямої фізичної взаємодії між двома партнерами, ми продовжимо експерименти з імунопреципітацією в різних клітинних клонах (MEF LRP +/+, MEF, що виражає лише позаклітинний домен LRP-1, MEF, що експресує лише внутрішньоклітинний домен LRP-1) після стимуляції IGF-1.

LRP фосфорилювання за допомогою IGF-1

Фосфорилювання цитоплазматичної частини LRP було описано після стимуляції в клітинах PDGF. Для того, щоб визначити, чи має IGF-1 однакову потужність, ми вивчимо стан фосфорилювання цитоплазматичного домену LRP, який може становити потенційну точку закріплення ShcA (шляхом імунопреципітації та аналізу за допомогою вестерн-блот або метаболічного мічення за допомогою Р [32 ])).

Outlook: Завдання 2Фенотипова характеристика мишей з дефіцитом ShcA на рівні VSMC або ендотеліальних клітин (ЕК):

Інактивація ShcA у VSMC буде досягнута шляхом схрещування трансгенних мишей SM22 Cre, специфічних для VSMC (подарованих д-ром Йоахімом Герцом, Південно-західний медичний центр UT, Даллас, Техас) з мишами ShcAflox/flox. ShcA також експресується в EC, іншому компоненті судинної стінки, який відіграє важливу роль у формуванні атеросклеротичних уражень. Інактивація ShcA в ЕС буде досягнута шляхом схрещування специфічних для ЕС трансгенних мишей Tie2-Cre (подаровані доктором М.Янагасіва, Південно-західний медичний центр UT, Даллас, Техас).
Для того, щоб підвищити сприйнятливість цих мишей до розвитку атеросклеротичних уражень, ми будемо схрещувати їх з мишами з дефіцитом ліпопротеїнових рецепторів ЛПНЩ (LDLr -/-) (вже доступні в лабораторії). 3–6-місячних тварин протягом 6–8 тижнів годуватимуть дієтою з високим вмістом холестерину та аналізуватимуть наявність атеросклеротичних уражень.

Аналіз фенотипу цих мишей дозволить зрозуміти роль, яку відіграє ShcA in vivo у розвитку атеросклеротичних уражень, та визначити, чи беруть участь механізми, продемонстровані для контролю проліферації клітин in vitro, також in vivo.