Стандартизований метод високопродуктивної стерилізації протоколу насіння арабідопсису (переклад на
Резюме
Метою цього дослідження було визначити вплив стерилізації відбілювачем та хлором на проростання насіння з ряду генотипів арабідопсису, вирощених на стерильних середовищах. Розроблено оптимізовані протоколи стерилізації для запобігання росту мікробних забруднень, забезпечуючи при цьому задовільну виживаність насіння.
Анотація
Вступ
Два основні методи, що використовуються для стерилізації насіння арабідопсису, залежать від товарного відбілювача (рідка фаза) та газоподібного хлору (парової фази). Для стерилізації рідкою фазою 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, стерилізації насіння 10 та парофазної арабідопсису 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 використовувались різні методи. Однак, хоча ці процедури були ефективними у здійсненні стерилізації насіння використовуваних генотипів, детальний аналіз ефекту стерилізації різних обробок на насіння різних генотипів не повідомлявся. Тому оптимізація цих процедур стерилізації необхідна для визначення умов, за яких ефективна стерилізація поєднується з високими показниками схожості.
Біологічний ресурсний центр Арабідопсис (ABRC) унікально розташований для того, щоб: а) перевірити життєздатність насіння різноманітних генотипів у колекції та b) скористатися перевагами процедур контролю якості, що застосовуються всередині, а також у відповідь на відгуки користувачів про схожість насіння. Представлені тут експерименти мали на меті визначити вплив різних методів стерилізації на схожість насіння ряду генотипів арабідопсису. Для стерилізації відбілювачем та газовим хлором показані оптимізовані процедури стерилізації, що призводять до високих показників схожості насіння, зберігаючи мінімальне забруднення патогенами.
Протокол
1. підготовка 1 х середовища Murashige і Skoog (MS)
2. Стерилізація насіння арабідопсису відбілювачем
3. Стерилізація насіння арабідопсису газоподібним хлором
4. Зростання арабідопсису на пластинах MS
Репрезентативні результати
Насіння арабідопсису, зібрані з відкритого поля, теплиці та ростової камери, інколи забруднені різними мікроорганізмами, такими як бактерії та гриби, 1, 4. Таким чином, пророщування насіння на стерильних середовищах може бути особливо складним через забруднення пластин, особливо якщо запас насіння обмежений. Оптимізований протокол стерилізації відбілювачем та газовим хлором, результати якого представлені нижче, мінімізує цю проблему та зберігає життєздатність насіння, необхідного для високої продуктивності.
Вплив стерилізації відбілювача на схожість насіння Arabidopsis Col-0
Відповідно до цих результатів, обробка концентрацією газу 6,1% протягом 1 год (таблиця 2) був обраний найкращим умовою парової фази для перевірки ефекту стерилізації газу на різних мутантних лініях, оскільки він поєднує (висока схожість 85%) з дуже низьким рівнем забруднення цвіллю (0,02%).
Вплив стерилізації хлоркою та хлором на насіння з різним потенціалом проростання
Статистичний аналіз показав, що реакція на проростання методів стерилізації залежала від пророщування ліній (рис. 3а, P Рисунок 3 a, P> 0,442, ANOVA), насіння, стерилізоване відбілювачем, має трохи вищу швидкість проростання насіння, стерилізованого газом, у всіх групах проростання.
Значно змінені процедури стерилізації (P Рисунок 3b). Як газова стерилізація, так і хлорний відбілювач призвели до зменшення цвілі (P Рисунок 3b, P> 0,4, ANOVA).
Обговорення
При посіві насіння арабідопсису на стерильне середовище слід застосовувати певну форму стерилізації. Процедури стерилізації відбілювачем та хлором призводять до подібних показників проростання та гальмування росту цвілі. Жоден метод стерилізації не призводить до значного зниження рівня схожості насіння з високим схожим потенціалом; Однак стерилізація відбілювачем рекомендується для ліній з меншим схожим потенціалом (від 20 до 70%) через невелике, хоча і не суттєве, покращення рівня схожості порівняно із газовою стерилізацією (Малюнок 3 a).
Насіння арабідопсису з концентрацією відбілювачів від 40 до 100% до 10 хв стерилізації забезпечує задовільну швидкість проростання та ефективне придушення цвілі. Хоча концентрація відбілювачів не менше 40% забезпечує адекватну стерилізацію для більшості партій насіння, використання концентрації 40% або вище гарантує ефективну стерилізацію навіть сильно забруднених партій насіння. Важливо не перевищувати 10 хв стерилізації при використанні відбілювача в концентрації, що дорівнює або перевищує 80%, щоб уникнути високої смертності насіння та вад розвитку сходів.
Обробка насіння арабідопсису концентрацією газоподібного хлору 6,1% або 16,5% протягом 1 години призводить до високого рівня проростання та адекватного видалення цвілі. Низьку концентрацію газоподібного хлору (2,1%) можна успішно використовувати, збільшивши час стерилізації до 3 год.
Коли потрібно простерилізувати кілька ліній, рекомендується стерилізувати рідину в 50% розчині відбілювача протягом 10 хв. Для більшої кількості ліній стерилізація газу з концентрацією газу 6,1% протягом 1 години є кращим варіантом, оскільки кілька ліній можна стерилізувати швидко і легко, з меншим обробкою.
Наші результати забезпечують стандартизовані умови для великої кількості насіння різних генотипів та насіння з меншим схожим потенціалом для стерилізації. Єдиним обмеженням цих методів стерилізації є те, що їх не можна застосовувати до насіння з коефіцієнтом схожості менше 20% через смертність насіння. Альтернативні методи, такі як ультразвук 17, для збільшення швидкості проростання за відсутності стерилізації можуть бути корисними в цих випадках.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Ми хотіли б подякувати Гаурі Датті за допомогу у підготовці експериментальних опор. Ми також вдячні Беттіні Вітлер та Джеймсу Манну за критичний огляд рукопису. Цю роботу підтримали гранти NSF DBI-1049341 та MCB-1143813.