Візуалізація Candida albicans в мишачому шлунково-кишковому тракті з використанням флуоресцентного In Situ
Резюме
Метою цього протоколу є візуалізація форми та локалізації клітин Candida albicans у шлунково-кишковому тракті ссавців.
Анотація
Candida albicans - це грибний компонент мікробіоти кишечника у людини та багатьох інших ссавців. Хоча C. albicans не викликає симптомів у більшості колонізованих господарів, коменсальний резервуар справді служить сховищем для інфекційних захворювань, а наявність високих грибкових молочних залоз у кишечнику пов’язане із запальними захворюваннями кишечника. Тут ми описуємо метод візуалізації морфології та локалізації клітин C. albicans у миші на моделі стабільної шлунково-кишкової колонізації. Колонізація встановлюється за допомогою одноразової дози C. albicans у тварин, які отримували пероральні антибіотики. Сегменти кишкової тканини прикріплені таким чином, щоб зберегти архітектуру просвітнього вмісту (мікроорганізмів та слизу), а також слизової оболонки хазяїна. Нарешті, флуоресцентна гібридизація in situ проводиться за допомогою зондів проти грибкової рРНК для фарбування C. albicans та гіф. Ключовою перевагою цього протоколу є те, що він дозволяє одночасно спостерігати морфологію клітини C. albicans та її просторову асоціацію зі структурами господаря під час колонізації шлунково-кишкового тракту.
Вступ
Candida albicans - це коменсал грибів, а також умовно-патогенний патоген людини. Ці дріжджі не мають визначеної екологічної ніші і натомість поширюються в шлунково-кишковому тракті (ШКТ), шкірі та сечостатевих шляхах людини та інших ссавців 1. Хоча ранні дослідження C. albicans зосереджувались головним чином на його потенції вірулентності, кілька останніх повідомлень свідчать про те, що поширення організмів у кишечнику може відігравати важливу роль у нормальному здоров'ї, включаючи імунний розвиток хазяїна. 2, 3, 4. Для полегшення досліджень коменсалізму C. albicans у кишечнику ссавців ми розробили мишачу модель стабільної колонізації ШКТ та метод флуоресценції in situ гібридизації (FISH) для візуалізації клітин грибкових дріжджів та гіф у просвіті кишечника.
У цій статті ми пропонуємо детальні інструкції щодо встановлення якісної колонізації C. albicans шлунково-кишкового тракту мишей, для розсічення травного тракту евтаназованих тварин, для прикріплення тканин таким чином, щоб зберегти просвіт для виявлення C. albicans у тканинах господаря з використанням FISH. На додаток до дикого типу та мутантних штамів C. albicans, техніку сортування можна використовувати для доставки інших мікроорганізмів. Техніка фіксації була б корисною для будь-якого дослідження, в якому бажано зберегти вміст кишечника. Процедура FISH може бути виконана за один день і може бути використана для виявлення декількох видів грибів за допомогою декількох зондів, маркованих по-різному.
Протокол
Викладені нижче кроки були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин UCSF (IACUC).
1. Шлунково-кишкова колонізація мишей C. albicans з використанням оральної матки
2. Підготовка шлунково-кишкової тканини до гістології
ПРИМІТКА: Цей розділ протоколу адаптований за Йоханссоном та Ханссоном 16 .
3. Валідація нещодавно сконструйованих зондів
ПРИМІТКА: Наступний протокол для перевірки зондів C. albicans був адаптований від Swidsinski et al. 17 .
4. Забруднення риб у тканинах ШКТ
Репрезентативні результати
Дотримуючись інструкцій, результатом цієї методики буде флуоресцентне мічення ядер в епітелії хазяїна, слизу та C. albicans у перерваних тканинах gi. Клітини дикого типу Candida albicans повинні виглядати як круглі, одноклітинні дріжджові клітини або сильно витягнуті, іноді розгалужені, багатоклітинні гіфи (поділ клітин у гіф не буде помітний). Мутанти C. albicans можуть додатково виглядати як менші та злегка витягнуті "сірі" дріжджі, або як більші та злегка витягнуті "кишки" (перехід, викликаний шлунково-кишковим трактом) або "непрозорі" дріжджі.
Фігура 1 зображує голку для годування, яка використовується для ротової матки, а також ключові положення голки під час процедури матражу. Малюнок 2 забезпечує типову установку, яка використовується для дисекції органів та появи шлунково-кишкових сегментів миші.
Малюнок 3E-G зображують C. albicans у товстому кишечнику мишей, забарвлених специфічним зондом C. albicans (рисунок 3Е) або панфунональний зонд (рис.3F, G). C. albicans на цих зображеннях виглядає червоним, ядра клітини-господаря сині, а шар слизу зелений. Як товсті кишки, так і дуже витягнуті гіфи (білі наконечники стріл) трапляються у товстій кишці. Зверніть увагу, що фарбування яскравіше за допомогою зонда-грибка. Малюнок 3G являє собою мутант ume6 у тому ж відсіку, забарвлений панфуноновим зондом. Ume6 кодує фактор транскрипції, який необхідний для утворення гіф в умовах in vitro 19. Цікаво, що заблокований фенотип дріжджів, що проявляється цим мутантом в умовах in vitro, не рекапітулюється в кишечнику, що припускає, що надлишковий фактор повинен бути активований у господаря 12. Малюнок 4 представляє появу диких типів C. albicans у різних сегментах мишачого шлунково-кишкового тракту, включаючи області, прилеглі до слизової оболонки хазяїна та більш центральні області просвіту кишечника.
Рисунок 1: Основні положення голка для годування під час примусового годування. (AT) Голова голка. () Голковий м’ячик для годування, вставлений збоку язика. (VS) Голка для годування у вертикальному положенні з введенням у стравохід. (D) Голка для введення, введена в шлунок, на кілька міліметрів видно над носом. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 2: Приклад макета розтин. (AT) Дисекційна накладка та інструменти. () Вирізаний шлунково-кишковий тракт. Проксимально (стравохід) від дистальних відділів (задній прохід): І. Шлунок. II. Проксимальна тонка кишка. III. Медіальна тонка кишка. IV. Дистальний відділ тонкої кишки. В. Сліпа кишка. VI. Товста кишка. Рожеві пунктирні коробки з пунктиром вказують на необхідність прикріплення тканин. (VS) Тканини, розташовані в касетах. Римські цифри такі самі, як і на панелі B. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього номера.
Рисунок 3: Репрезентативні зображення C. albicans забарвленийриба. (AT) РИБА з гіф C. albicans, вирощених у рідкому середовищі Lee 18 з 2% N-ацетилглюкозаміном, рН 6,8. () РИБА з клітин дріжджів C. albicans, культивованих на YEPD - 2% агарові пластини. (VS) РИБА клітин GUT C. albicans (ySN1045), культивованих на планшетах YEPD - 2% агар. (D) РИБА з непрозорих клітин C. albicans, вирощених на YEPD - 2% агарові пластини. (Е) Дикий тип C. albicans (ySN250) у товстій кишці, забарвлений зондом c. albicans-specific. (F) Дикий тип C. albicans у товстій кишці, забарвлений паніфгічною трубкою. (G) Мутант Ume6 (ySN1479) у товстій кишці, забарвлений панфуноновим зондом: червоний - C. albicans, синій - господар для ядер епітелію, а зелений - муцин. Стрілки вказують на гіфи. Стрілки вказують на дріжджі. Масштабні бруски 20 м. Зображення F та G адаптовані за посиланням Witchley et al. 12. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 4: Зовнішній вигляд C. albicans забарвлений риба в різних відділах кишечника. Дикий тип C. albicans зазначений у зазначених сегментах шлунково-кишкового тракту миші. У межах кожного відділення зображення представляють область, прилеглу до слизової оболонки господаря та центральну область просвіту кишечника. Фарбування проводили за допомогою грибкового зонда. 20 м шкала. Зображення адаптовані від Witchley et al. 12. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
| Запаси антибіотиків (200x) | |||
| Пеніцилін G | 181 мг/мл | ||
| Стрептоміцин | 400 мг/л | ||
| Метакарн | |||
| запас | Кінцева концентрація | гучність | Одиниці |
| Метанол | 60% | 300 | мл |
| хлороформ | 30% | 150 | мл |
| Льодова оцтова кислота | 10% | 50 | мл |
| Розчин для гібридизації | |||
| запас | Кінцева концентрація | гучність | Одиниці |
| 1 М трис-HCl, рН 7,4 | 20 мМ | 20 | Μl |
| 5 М NaCl | 0,9 млн | 180 | Μl |
| 10% SDS | 0,10% | 10 | Μl |
| 100% формамід | 1,00% | 10 | L (зберігається в малих аліквотах при -20oC між використаннями) |
| Вода без РНази | 780 | Μl | |
| РИБНИЙ промивний розчин | |||
| 1 М трис-HCl, рН 7,4 | 20 мМ | 1 | мл |
| 5 М NaCl | 0,9 млн | 9 | мл |
| Вода без РНази | 40 | мл | |
| Розчин для фарбування ядер муцину | |||
| DAPI, 10 г/мл | 20 нг/мл | 2 | Μl |
| лектину, 40 г/мл | 1,6 г/мл | 40 | Μl |
| PBS, рН 7,4 | 958 | Μl | |
Таблиця 1: Типові обсяги та концентрації розчинів, що використовуються у цьому протоколі.
Обговорення
Описаний тут спосіб дозволяє візуалізувати дріжджі та гіфи C. albicans у шлунково-кишковому тракті колонізованих мишей будь-якої статі або штаму. Зонд FISH гібридизується з 23S рРНК, яка розподіляється по всій грибковій цитоплазмі. Наш метод був адаптований до раніше повідомленого протоколу для візуалізації кишкових бактерій 20. Оскільки C. albicans змінює свою морфологію всередині хазяїна, метод корисний для моніторингу форми клітин гриба, а також локалізації. Наприклад, ми використали цей метод, щоб спростувати гіпотезу про те, що дріжджі переважають у всьому травному тракті, та викрити відмінності між фенотипами in vivo та in vitro деяких мутантів із “дефектом нитки” 12 .
Існує кілька моделей мишей для коменсальної колонізації C. albicans. Мікробіота лабораторних мишей і людей відрізняється, і для мишей необхідне використання антибіотиків або спеціалізованої дієти для встановлення стабільної колонізації. Лікування антибіотиками також покращує колонізацію C. albicans у людей і є основним фактором ризику поширення захворювання 10. Антибіотики, використані в цьому дослідженні, відносно недорогі і дають достовірне зниження мікробіоти бактерій. Зверніть увагу, що антибіотики використовуються для зменшення навантаження на антагоністичні види бактерій, а не для усунення всіх бактерій від тварин. Якщо дослідники хочуть вивчити взаємодію C. albicans та хазяїна за відсутності бактерій або щоб уникнути використання антибіотиків або спеціальної дієти, тварини, що не містять мікробів, можуть бути замінені тваринами, що вирощуються звичайно; однак гнотобіотичні миші демонструють певні імунні та анатомічні відхилення, і тому можуть бути непридатними для всіх цілей.
Для успішного фарбування FISH важливо кілька етапів: Рекомендований спосіб фіксації є важливим для збереження структурної цілісності тканин шлунково-кишкового тракту, особливо тендітного вмісту кишечника просвіту, наприклад, слизового шару та тривимірної організації грибів та бактерій 16 . Зверніть увагу, що багато часто використовуваних фіксуючих розчинів, що містять воду, дуже шкодять світловій архітектурі. Закріплювачі та розчини для промивань після фіксації, рекомендовані в цьому протоколі, не містять води, і важливо уникати забруднення води. Іншим важливим етапом є етап гібридизації, де важливо уникати випаровування гібридизаційного розчину при інкубації предметних стекол у гібридизаційній печі. Щоб уникнути цієї проблеми, ми пропонуємо розмістити слайди у водонепроникному контейнері. В якості альтернативи можуть бути використані герметичні камери гібридизації, такі як спочатку використовувані для гібридизації мікрочипів.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Автори висловлюють подяку Кароліні Тропіні, Кетрін Нг, Джастіну Зонненбургу та К.Ц. Хуангу за їх керівництво у розвитку техніки FISH. Тереза О'Меара надала корисні коментарі щодо рукопису, а Міріам Леві допомогла у фотографуванні. Ця робота була підтримана грантами від NIH R01AI108992, R01DK113788 та нагородою Берроуза з привітання в патогенезі інфекційних хвороб.