Вплив індуцибельної гемоксигенази (HO-1) на мікроциркуляцію в
З клінічного відділу хірургічного університету загальної та вісцеральної хірургії Фрайбурзького університету імені Альберта Людвіга i.br. Вплив індуцибельної гемоксигенази (HO-1) на мікроциркуляцію при постішемічному панкреатиті I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N для отримання ступеня доктора медичного факультету Альберт-Людвігс-Університету Фрайбурга i.br. Представлений у 2006 році Моріцем Шольтесом, який народився в Аахені
2 декан: проф. мед. C. Peters 1-й рецензент: PD Dr. мед. О. Томуш 2-й рецензент: проф. мед. B. Розбиття Рік випуску: 2007
4 Цю роботу контролював д-р. мед. Е. фон Добшюц
5 ЗМІСТ 1. ВСТУП. 7 1.1 ГОСТРИЙ ПАНКРЕАТИТ. 7 1.2 Мікроциркуляція. 8 1.3 РЕФЕРФУЗІЯ ІШЕМІЇ. 9 1.4 ГЕМЕГРАДАЦІЯ ВІД ГЕМОКСИГЕНАЗИ. 11 1.4.1 Реакція гемоксигенази та її продуктів. 12 1.4.1.1 Залізо. 13 1.4.1.2 CO. 13 1.4.1.3 Білівердин та білірубін. 13 1.4.2 Ізоферменти HO: структура, розподіл, регуляція. 14 2. ЦІЛЬ ВИВЧЕННЯ. 17 3. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ. 18 3.1 ПОПЕРЕДНЯ ПРИМІТКА. 18 3.2 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МОДЕЛЬ. 18 3.2.1 Дослідні тварини. 18 3.2.2 Попереднє лікування та прийом ліків. 18 3.2.3 Анестезія та вентиляція. 19 3.2.4 Мікрохірургічна технологія. 20 3.3 МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ. 23 3.3.1 Макрогемодинаміка. 23 3.3.2 Мікрогемодинаміка. 23 3.3.2.1 Функціональна щільність капілярів. 24 3.3.2.2 Лейкоцито-ендотеліальна взаємодія. 25 3.3.3 Лабораторні параметри. 26 3.3.4 Визначення HO-1. 26 3.3.4.1 Доказ діяльності. 27 3.3.4.2 Аналіз Норт-блот. 29 3.3.4.3 Вестерн-блот-аналіз. 31 3.4 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ ПРОТОКОЛ. 32 3.4.1 Тестові групи. 32 3.4.2 Процедура випробування. 32 3.4.2.1 Умови контролю. 32 3.4.2.2 Ішемічно-реперфузійний панкреатит. 33 3.4.2.3 Індукція гемоксигенази 1. 34 3.4.2.4 Інгібування активності гемоксигенази. 35 3.5 СТАТИСТИКА. 35
6 4. РЕЗУЛЬТАТИ. 36 4.1 МАКРОХЕМОДИНАМІКА. 36 4.2 МІКРОХЕМОДИНАМІКА. 38 4.2.1 Функціональна щільність капілярів. 38 4.2.2 Лейкоцитарно-ендотеліальна взаємодія. 41 4.3 ЛАБОРАТОРНІ ПАРАМЕТРИ. 44 4.4 ВИЗНАЧЕННЯ ГЕМОКСИГЕНАЗИ. 45 4.4.1 Доказ діяльності. 45 4.4.2 Норт-блот. 46 4.4.3 Вестерн-блот. 47 4.5 ОГЛЯД. 47 5. ОБГОВОРЕННЯ. 48 5.1 ОБГОВОРЕННЯ МЕТОДОЛОГІЇ. 48 5.1.1 Експериментальний гострий панкреатит. 48 5.1.2 Вимірювані параметри. 51 5.1.2.1 Кількісна оцінка мікрогемодинаміки. 51 5.1.2.2 Кількісна оцінка лейкоцитарно-ендотеліальної взаємодії. 53 5.1.2.3 Доказ діяльності. 55 5.1.2.4 Норт-блот. 56 5.1.2.5 Вестерн-блот. 57 5.2 ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ. 58 5.2.1 Вплив ішемії та реперфузії. 58 5.2.1.1 Макрогемодинаміка. 58 5.2.1.2 Мікрогемодинаміка. 58 5.2.1.3 Лейкоцито-ендотеліальна взаємодія. 62 5.2.1.4 Експресія та активність гемоксигенази. 63 5.2.2 Вплив HO-1. 65 5.2.2.1 Макрогемодинаміка. 66 5.2.2.2 Мікрогемодинаміка. 66 5.2.2.3 Лейкоцито-ендотеліальна взаємодія. 69 5.2.2.4 Експресія та активність гемоксигенази. 71 6. РЕЗЮМЕ. 72 7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ. 73 8. СПИСОК ФІГУР І ТАБЛИЦ. 92 9. СПИСОК СКОРОЧЕНЬ. 95 10. ПОДЯКИ. 96 11. ЖИТТЯ. 98
10 Ці механізми призводять до розладу мікроциркуляції, що, в свою чергу, призводить до зменшення енергопостачання тканини і, таким чином, утримує порочне коло (рис. Na + -K + - АТФаза Na + -Ca 2+ - Антипорт АТФ Na + Ca 2+ Протеази XDh O 2 Hyx + XOx Ішемія Кров-O 2 Реперфузія O 2 -радикальна проникність Набряк Тромбоз Згущення лейкоцитів Деградація ECM Пошкодження мембрани Мікроциркуляція Розлад активації лейкоцитів Пошкодження клітин Пошкодження ендотелію Ферменти Цитокіни Рисунок 1: Порочне коло ішемічно-реперфузійного пошкодження: Процеси при ішемії (вгорі) спричиняють пошкодження клітин при реперфузії (внизу), що призводить до подальшого гіпоксичного пошкодження тканини
17 2. ЦІЛЬ ВИВЧЕННЯ Метою цього експериментального дослідження було дослідити вплив одногодинної ішемії та двогодинної реперфузії на мікроциркуляцію підшлункової залози. Було вивчено, чи і як умови змінюються з часом. Крім того, слід визначити, чи і яким чином екзогенна індукція індуцибельної гемоксигенази (HO-1) впливає на ці умови. Зокрема, досліджували функціональну щільність капілярів як параметр ситуації з харчуванням при реперфузії та взаємодію лейкоцитів та ендотелію як параметр ранньої запальної реакції. Для визначення цих параметрів застосовували метод інтравітальної епіфлуоресцентної мікроскопії. Вплив гемоксигенази на її експресію та активність було перевірено молекулярною біологією. Робота розділена на наступні розділи: 1. Вплив ішемії та реперфузії на мікроциркуляцію підшлункової залози без екзогенного впливу на оксигеназу гему 2. Ефекти індукції гемоксигенази на мікроциркуляцію підшлункової залози при постішемічному панкреатиті
22 Рисунок 5: Схематичний перебіг судин в артеріях підшлункової залози (від HOFFMANN 70)