З акушерської клініки

1 З клініки акушерства медичного факультету університету Шаріте Берлін ДИСЕРТАЦІЯ Th 1 -цитокіни та протромбіназа fgl2 при нормальній та патологічній вагітності Подано на медичний факультет Харіте Університету Гумбольдта з метою здобуття вченого ступеня доктора медичних наук (доктор медичних наук) Берлін від Берлінської Майки Кнакштедт

акушерської

2 декани: проф. Д-р мед. Ж.-В. Дуденгаузен проф. Д-р мед. Matin Paul Рецензент: 1. Проф. Д-р. мед. Ж.-В. Дуденгаузен 2. Проф. Д-р. мед. хабіл. Х. Донат 3. Проф. Д-р. мед. Г. Шенфельдер Дата доктора: 24 вересня 2004 р

3 Зміст 3 Зміст Список скорочень 5 Цілі 6 1 Вступ Основи імплантації ембріона Початок вагітності Модель трансплантації Патологічна імплантація Імунологічні основи вагітності Парадигма Th 1/Th 2 Роль цитокінів Th 1 у вагітності Наслідки імунологічного дисбалансу під час вагітності Активація системи згортання крові Роль апоптозу при вагітності Аспекти спонтанного аборту Імунологічні принципи спонтанного аборту Дві моделі абортів у мишей CBA/J: стрес проти ІЛ імунологічні аспекти гестозу Питання 21 2 Матеріал та методи Випробування тварин Колектив пацієнтів Експериментальна установка експериментів на тваринах Частота абортів у відсотках Підготовка тканин Тотальна екстракція РНК ДНК-обробка зразків РНК Зворотна транскрипція Якісна ПЛР Електрофорез на агарозі Кількісний ПЛР-аналіз даних Taq-Man Підготовка плазмідної ДНК в дрібномасштабна (міні підготовка) лінеаризація синтезу кДНК плазміди 35-міченого РНК-зонда in situ гібридизація імуногістохімія TUNEL фарбування Гімза фарбування статистичний аналіз даних 41

4 Зміст 4 3 Результати Збільшення швидкості переривання вагітності через стрес та ін’єкцію IL-12 p Вплив стресу на експресію мрна абортогенних цитокінів Збільшення TNF-α мрна після дії стресу Експресія IFN-γ після застосування стресу Die Вплив експресії мрна IL-12 під впливом стресу Співвідношення швидкості переривання вагітності до кількісної кількості цитокінів Профіль цитокінів після ін'єкції ІЛ Порівняння експресії fgl2 мрна при стресі та після ін'єкції ІЛ Індукція апоптозу стресом та ІЛ -12 у моделі миші Експресія TNF-α у першому триместрі та третьому триместрі Експресія білка fgl2 мрна та fgl2 у тканині плаценти людини Перший триместр Третій триместр Апоптоз при прееклампсії та спонтанному аборті 59 4 Дискусія 61 5 Резюме 72 6 Список публікацій 74 7 Додаток 91

5 Список абревіатур 5 Список абревіатур// Збільшення/Зменшення/константа ASA Ацетилсаліцилова кислота CD Кластер диференціації ДНК Дезоксирибонуклеїнова кислота (A = кислота) COX Циклооксигеназа EGF Епідермальний фактор росту fgl2 Фібриноген-подібний білок Hemo-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-білок HOR-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-білок-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-білок-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-геноген-генофан Трансфераза IDO Індоламін-2,3-Діоксигеназа IFN-γ Інтерферон-гамма ІЛ Інтерлейкін IRF Інтерферон-регулюючий фактор LIF Лейкемія-інгібуючий фактор LPS Ліпополісахарид MHC Основний-Гістосумісність-Комплекс MHV3 Мишачий гепатит-вірус MNA-макрофафа-макрофафа mrna (месенджер) рибонуклеїнова кислота (A = кислота) NK-клітини/unK-клітини Природні клітини-вбивці/маточні NK-клітини NO-оксид азоту NOS (inos) -синтаза оксиду азоту (індукована синтаза оксиду азоту) OX-орексин = CD 200 PAI інгібітор активатора плазміногену ПЛР ланцюгова реакція полімерази ПЕ прееклампсія ПМНЛ поліморфно-ядерні лейкоцити RT зворотна транскриптаза TGF трансформуючий фактор росту Th T допоміжна клітина Фактор некрозу пухлини TNF-α-альфа-фактор росту судинного ендотелію VEGF

6 Завдання 6 Завдання Завданням даної дипломної роботи є встановлення на моделі миші 1 із комбінацією спарень CBA/J-самки та DBA/2J-самців різницю в цитокіновому профілі матки та роль протромбінази, фібриноген-подібного білка 2 (короткий fgl2) у стресово-викликаному або аборти, викликані запаленням. 2, щоб охарактеризувати цитокіновий профіль у зв'язку з можливою активацією системи згортання через fgl2 як протромбінази в децидуальній тканині пацієнтів із нормальною вагітністю та пацієнтів у першому триместрі з абортами. 3 для опису експресії цитокінів Th 1 та fgl2 у тканині плаценти у пацієнтів з неускладненим перебігом вагітності та пацієнтів з гестозом у третьому триместрі.

22 Вступ 22 Ускладнення вагітності Обстежуються мимовільний аборт та гестоз та зв’язок з імунологічним дисбалансом.

25 Матеріал та методи 25 Імплантаційна резорбція Рисунок 3: Зображення одного з бічних рогів V-подібної матки миші Показано дві імплантації () та дві резорбції () в матці миші на 13,5 день гестації, тому лежить у бічному розі матки, показаному вище аборт 50%. 2.5 Підготовка тканин Для молекулярно-біологічних досліджень 100 мг тканини матки готували з місць успішної імплантації та ретельно промивали стерильним PBS (pH = 7,4), а потім негайно заморожували за допомогою рідкого азоту і зберігали при 80 C до виділення РНК. З боку резорбції не брали зразків тканини, оскільки тканина вже геморагічно та некротично розкладалася, і пробні тести показали, що ця тканина непридатна для діагностики цитокінів. 2.6 Матеріал загальної екстракції РНК: тризол хлороформ, етанол (100%, 75%), агарозний гель, 1,5%, бромід етидуіму (10 мг/мл), центрифуга для деспергістації (5415C), Gibco BRL, Карлсруе, D Мерк, Дармштадт, Д Мерк, Дармштадт, D Biozym, Oldendorf, D Gibco BRL, Karlsruhe, DT 8.10, IKA Labortechnik Eppendorf, Hamburg, D

31 Матеріал та методи 31 (гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза), отриманий як еталонний ген. Всі зонди перевіряли на їх специфічність для кдн, тобто геномна ДНК не ампліфікувалася. Послідовності праймерів: Мурини HPRT: Приклад 7,8: 5 -gttggatacaggccagactttgt Реверс: 5 -CACAggACTAgAACACCTgC Миші IFN-γ: Вперед: 5 -CagCAACAACATAAgCgTCAT Реверс: 5 -CTCCTTTTCCgCTTCgtgcgTgcgTgTgCgTgCgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgTgCgTgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgCgTgTgCgTgTg Миші fgl2: Вперед: 5 -CAACAgTTTggATggCAAgTg Реверс: 5 -CTTTgTATATTAgATgAACCgg Миші IL-12 p40: Вперед: 5 -TTCAgTgTCCTgCCAggAgg Назад: 5 -CgggTCTCCGGTTTGATgATg HPRT: 5-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p Температура ПЛР: 60 C або 63 C Миші IFN-γ: 5-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p Температура ПЛР: 60 C Миші TNF-α: 5-6FAM-gTAgACAAggT Температура ПЛР: 63 C Миші fgl2: 5-6FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gca p Температура ПЛР: 63 C

41 Матеріал та методи Статистичний аналіз даних Для напівкількісної оцінки імуногістохімії використовували порядкову шкалу з оцінками +/++/+++. Для статистичного аналізу цих даних використовували U-тест Манна-Уітні як непараметричний тест для незалежних вибірок. Дані відображаються графічно на графіках вікон. ПЛР у реальному часі оцінювали, як описано вище. Після приблизного тесту на нормальний розподіл дані оцінювали за допомогою тесту Стьюдента і представляли на гістограмах зі стандартним відхиленням.

47 Результати 47 Так само, IL-12 p40 (r = 0,24) та IL-12 p35 (r = -0,29) не демонструють жодного зв’язку з часткою резорбцій (рис. 11 та рис. 12)% абортів r = IL-12 p40mrna Рисунок 11: Кореляція між відсотком абортів та кількістю вираженого IL-12 р40 мрна Не існує кореляції між кількістю IL-12 p40 та відсотком резорбції% абортів r = IL-12 p35 мрна Рисунок 12: Взаємозв'язок між рівнем абортів у відсотках і кількістю вираженого IL-12 p35 мрна. Не існує кореляції між кількістю IL-12 p35 та відсотком резорбції.

48 Результати Профіль цитокінів після ін’єкції IL-12 Питання полягає в тому, чи може IL-12, як активний Т-клітинний цитокін, викликати імунну відповідь Th 1 у миші, що потім призводить до збільшення швидкості абортів. Після ін'єкції IL-12 вимірювання показали 9,5-кратне збільшення IFN-γ мрна (рис. 13). Цікаво, що введений рекомбінантний IL-12 також мав вплив на експресію TNF-α: Після ін’єкції експресія TNF-α мрна збільшилася у 8,8 разів (рис. 13). Після стимуляції IL-12, отже, було порівняно сузір'я цитокінів з одночасною присутністю великої кількості TNF-α та IFN-γ, як при одночасному введенні обох цитокінів: 10 8 разів більше, ніж мрна m = 5 n = 7 n = 7 контроль, відсутність ін'єкції IFN-γ мрна після ін'єкції IL-12 TNF-α мрна після ін'єкції IL-12 Рисунок 13: Регуляція цитокінів після ін'єкції IL-12 p70 Значне збільшення TNF-α та IFN-γ після Ін'єкція рекомбінантного IL-12 p Порівняння експресії fgl2 мрна під час стресу та після ін'єкції IL-12. Гібридизація in situ гістологічно показує локалізацію fgl2 мрна в матці мишей CBA/J на ​​13,5 день Вагітність (малюнок 14).

50 Результати 50 Однак було встановлено, що кількість TNF-α-мрна негативно пов'язана з кількістю fgl2-мрна (рис. 16). Статистично чіткого зв'язку між fgl2 mrna та IFN-γ mrna не було (рис. 17). 9,5 9,0 TNF-α мрна 8,5 8,0 7,5 7,0 r = Fgl2 мрна 6 8 Рисунок 16: Зв'язок між кількістю TNF-α та кількістю fgl2 мрна Кореляція між кількістю TNF-α та кількістю fgl2 мрна, негативна залежність між двома параметрами може розглядатися як тенденція. 14 IFN- γ мрна r = 0, Fgl2 мрна 6 8 Рисунок 17: Зв'язок між кількістю IFN-γ мрна та вираженою кількістю fgl2 мрна Не існує кореляції між кількістю IFN-γ та кількістю fgl2 мрна.

53 Результати 53 A B Рисунок 20: Імуногістохімія TNF-α у плаценті 3 триместру при нормальній вагітності (A) показує контроль IgG, а (B) - фарбування білка TNF-α. A B Посудина трофобластів Рисунок 21: Імуногістохімія TNF-α у плаценті 3 триместру у пацієнтів з гестозом (A) показує контроль IgG, а (B) - фарбування білка TNF-α. У таблиці 1 наведено специфічний аналіз білків-позитивних клітин TNF-α при прееклампсії: Походження тканини Ендотелій Трофобласт Плацентарні макрофаги ПЕ (n = 10) +/++ + +/++ Контроль (n = 12) + +/- +/++ Таблиця 1: Імуногістохімія TNF-α у плаценті III триместру при нормальній вагітності та у пацієнтів з прееклампсією Підвищена експресія білка TNF-α в ендотеліальних клітинах та трофобластах при прееклампсії (PE) порівняно із нормальною вагітністю. Відсутність різниці у експресії білка TNF-α у клітинах трофобластів та плацентарних макрофагах.

54 Результати Експресія mgl2 fgl2 та білка fgl2 у тканині плаценти людини Перший триместр На рисунку 22 наведені дані, отримані за допомогою гібридизації in situ. A B Рисунок 22: Гібридизація in situ для ворсин fgl2 mrna 1 триместру (A) показує сенсорний контроль, а (B) - антисмислове фарбування fgl2 mrna. Показані плацентарні ворсинки з двоклітинним шаром трофобластів, що складається з синцитіотрофобластів та цитотрофобластів, характерних для першого триместру. Гібридизацію in situ проводили за допомогою 35-міченого зонда fgl2 mrna. В обох показаних ворсинках є типове чорне маркування шару трофобласта в антисмисловому зразку, при цьому зразок mrna є дзеркальним відображенням послідовності mgna fgl2. У негативному контролі, сенсовому зразку, в якому зразок ідентичний послідовності fgl2-mrna, немає позитивного сигналу. Трофобласт також показує позитивні сигнали (коричневий) для білка fgl2 в імуногістохімії (рис. 21).

55 Результати 55 A B Рисунок 23: Імуногістохімія fgl2 у плаценті 1 триместру при нормальній вагітності (A) показує контроль IgG, а (B) - фарбування білка fgl2 та репрезентативний ділянку судини. Ці результати вперше показують, що fgl2 мрна і білок fgl2 експресуються в клітинах трофобластів людини, особливо якщо стався спонтанний аборт. Кількість fgl2-позитивних судин у загальній кількості судин була збільшена, якщо стався спонтанний аборт (рис. 24). Позитивні судини Fgl2/загальна кількість судин 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 6 * n =% медіана 25% контроль спонтанного аборту Рисунок 24: Експресія білка fgl2 в ендотеліальних клітинах Судини першого триместру Напівкількісний аналіз імуногістохімії на вміст fgl2 на судинах децидуальної основи контролю та спонтанного аборту.

56 Результати 56 Напівкількісна оцінка експресії fgl2 зоттичних трофобластів показує, що у пацієнтів з абортом експресія fgl2 вища, ніж у пацієнтів із плановим перериванням вагітності (рис. 25). Інтенсивність забарвлення fgl2 позитивних зоттичних трофобластів 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 n = 6 * n = 9 75% медіана 25% контроль спонтанного аборту Рисунок 25: Експресія білка fgl2 у трофобластах першого триместру Напівкількісний аналіз імуногістохімії fgl2 на клітинах трофобластів decidua basalis при контролі та спонтанному аборті трофобластів судин AB Рисунок 26: Імуногістохімія fgl2 у плаценті 1-го триместру абортів пацієнтів (A) показує контроль IgG та (B) показує фарбування білка fgl2 та репрезентативну ділянку судини.

58 Результати 58 На малюнку 28 показано зрілі ворсинки плаценти у третьому триместрі з нормальним перебігом вагітності. Клітини трофобластів час від часу експресують білок fgl2 (Малюнок 26 B). Фігура 29 показує плаценту пацієнта з гестозом, при цьому трофобласти експресують білок fgl2 більш однорідно. Судини A B Рисунок 28: Імуногістохімія fgl2 у плаценті 3 триместру при нормальній вагітності (A) показує контроль IgG, а (B) - фарбування білка fgl2. A B Рисунок 29: Імуногістохімія fgl2 у плаценті 3 триместру пацієнтів з гестозом (A) показує контроль IgG, а (B) - фарбування білка fgl2. Відповідно до цього спостереження, вражаючі відкладення фібрину можна спостерігати у зразках плаценти у хворих на гестоз порівняно із зразками плаценти при неускладненій вагітності.

59 Результати Апоптоз при прееклампсії та спонтанному аборті Цитокіни Th 1, особливо TNF-α, здатні викликати запрограмовану загибель клітин у формі апоптозу. Дослідження апоптотичних сигналів у першому триместрі та у третьому триместрі показало, що значно більша частота апоптозу спостерігалася як у децидуї, так і у плаценті прееклампсії (рис. 30). A TUNEL + клітини на зорове поле 2,5 * 2,0 1,5 n = 5 1,0 0,5 5 n = 6 B TUNEL + клітини на зорове поле * n = n =% медіана 25% 4 контроль спонтанного аборту контроль прееклампсії Рисунок 30: Апоптоз у першому та третьому триместрах А: Напівкількісний аналіз апоптотичних сигналів при спонтанному аборті. B: Напівкількісний аналіз апоптотичних сигналів при прееклампсії.

60 Результати 60 На малюнку 31 показано апоптоз у плаценті у третьому триместрі. Рисунок 31: Апоптоз у третьому триместрі Ядра клітини забарвлені в синій колір, а апоптотичні фрагменти флуоресцирують зеленим.